错配修复蛋白表达缺失与结直肠癌病理特征及预后的关系

李东松，陈娉珊，蔡泰楠，蔡泽华，丁玉芝，童昊

摘要：目的  探討错配修复蛋白的表达状态与结直肠癌病理特征和预后的关系。方法  纳入于2016年9月-2022年9月在潮州市人民医院诊治的190例临床及病理资料完整的结直肠癌患者进行分析。通过免疫组化方法检测病理标本中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表达状态，其中有一个表达缺失则为dMMR组，全部均有表达则分为pMMR组。分析两组患者病理特征及预后情况。结果  错配修复蛋白总缺失率为21.58%。两组患者的肿瘤大小、部位、淋巴结转移、肿瘤病理分期与错配修复蛋白表达状态具有相关性（P＜0.05），而肿瘤组织学类型、肿瘤分化程度、神经和/或脉管侵犯与错配修复蛋白表达状态不具相关性（P＞0.05）。Kaplan-Meier分析显示，dMMR组患者无病生存时间和总生存时间均优于pMMR组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论  错配修复蛋白表达状态与结直肠癌的肿瘤大小、部位、淋巴结转移、肿瘤病理分期有密切关系，同时错配修复蛋白缺失患者的无病生存时间和总生存时间也较长，提示预后较好。

关键词：错配修复蛋白；结直肠癌；病理特征；预后

中图分类号：R656.9                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.08.019

文章编号：1006-1959（2024）08-0099-05

Relationship Between the Loss of Mismatch Repair Protein Expression and the Pathological Feature

and Prognosis of Colorectal Cancer

LI Dong-song1，CHEN Ping-shan2，CAI Tai-nan2，CAI Ze-hua3，DING Yu-zhi1，TONG Hao1

（Department of Hepatobiliary Surgery1，Department of Pathology2，Department of Gastrointestinal Surgery3，

People's Hospital of Chaozhou City，Chaozhou 521011，Guangdong，China）

Abstract：Objective  To investigate the relationship between the expression of mismatch repair protein and the pathological characteristics and prognosis of colorectal cancer.Methods  A total of 190 patients with colorectal cancer with complete clinical and pathological data who were treated in Peoples Hospital of Chaozhou City from September 2016 to September 2022 were included in the analysis. The expression of MLH1， MSH2， MSH6 and PMS2 in pathological specimens was detected by immunohistochemistry. One of the expression deletions was dMMR group， and all of them were divided into pMMR group. The pathological characteristics and prognosis of the two groups were analyzed.Results  The total deletion rate of mismatch repair protein was 21.58%. The tumor size， location， lymph node metastasis， tumor pathological stage of the two groups were correlated with the expression of mismatch repair protein （P<0.05）， while there was no correlation between the expression of mismatch repair protein and the histological type of tumor， the degree of tumor differentiation， nerve and/or vascular invasion （P>0.05）. Kaplan-Meier analysis showed that the disease-free survival time and overall survival time of patients in the dMMR group were better than those in the pMMR group， and the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion  The expression of mismatch repair protein is closely related to the tumor size， location， lymph node metastasis and pathological stage of colorectal cancer. At the same time， the disease-free survival time and total survival time of patients with mismatch repair protein deletion are also longer， suggesting a better prognosis.

Key words：Mismatch repair protein;Colorectal cancer;Pathological feature;Prognosis

结直肠癌（colorectal cancer）是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率有逐年增加的趋势，在全球范围内其发病率、病死率占全部恶性肿瘤的第3位、第2位，而在我国其比例分别为第3位和第5位[1，2]。结直肠癌的发生和进展是一个受多种因素影响、有多条途径的复杂过程，通常认为其发生途径有3条，即染色体不稳定（chmmosomal instability， CIN）途径、微卫星不稳定（micmsatellite instability， MSI）途径和CPG岛甲基化[3，4]。其中CIN是最主要的发病机制，另有10%～20%的结直肠癌由MSI引起[5，6]。MSI主要由错配修复蛋白（mismacth repai protein， MMRP）缺陷造成，是肿瘤组织中某一微卫星由于复制差错引发的简单重复序列的插入或缺失而造成的微卫星长度的改变，导致结构性等位基因的大小变化，出现新的微卫星等位基因现象。MMRP相关蛋白主要有MLH1、MSH2、MSH6和PMS2，当中任意一个蛋白表达完全缺失则为错配修复功能缺失（dMMR），所有蛋白表达均为阳性则为错配修复功能正常（pMMR）。有研究显示[7，8]，dMMR与结直肠癌的病理特征有密切相关性，但与肿瘤的预后仍存在争议。本研究收集了190例结直肠癌患者的临床及病理资料，对其中MMRP表达情况及与肿瘤病理特征的关系进行分析，现将结果进行报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料  选取于2016年9月-2022年9月在潮州市人民医院住院，并行手术治疗的结直肠癌患者的临床及病理资料进行分析。本研究获得医院倫理委员审批通过，并取得所有患者的知情同意。纳入标准：①病理及临床资料完整；②肿瘤为初发、原发、单发；③行结直肠癌根治术；④术前有肠镜病理证实为恶性肿瘤，术后再次行病理及免疫组化检查，术后病理经两名主治及以上医师阅片；⑤术前未经化疗、放疗及靶向治疗等辅助治疗。排除标准：①病理及临床资料不完整；②肿瘤为复发、多发，或合并其它组织器官恶性肿瘤；③术前曾行过化疗、放疗及靶向治疗；④术前肿瘤有远处转移。最终纳入病例共190例，其中男性患者102例，女性患者88例，平均年龄（57.59±4.71）岁，合并高血压和/或糖尿病24例。

1.2方法

1.2.1 MMRP检测方法  ①取经过福尔马林固定、石蜡包埋的切片进行抗原修复。石蜡切片脱蜡、水化，自来水冲洗并浸泡于水中待用，取适量已稀释成工作液的抗原修复液（EDTA法）置入压力锅中，并大功率加热至沸腾，后将功率调至中度，将切片置于耐热的染色架上，放入沸腾的修复液中，盖上锅盖后继续加热至压力阀喷气1.5～2 min，将压力锅移开，置于室温中自然冷却10 min，待冷却后取出切片，以自来水冲洗，后再PBS冲洗2次，每次3 min。②将处理好的切片进行DAB显色。按0.85 ml蒸馏水分别加入DAB缓冲液、DAB底物、DAB色原各50 μl的比例混均配制，滴加适量配制好的显色液于切片上，室温下静置2～10 min后在显微镜下观察结果并控制染色时间。实验室所用的抗原修复液、DAB缓冲液、DAB底物、DAB色原等试剂均由福州迈新生物技术开发有限公司生产，在操作过程中严格按照试验盒说明进行操作。

1.2.2 MMRP的判读  以细胞核心出现棕色颗粒为MMRP阳性细胞，0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。0分无阳性，1分为阳性细胞≤10%，2分为阳性细胞11%～50%，3分为阳性细胞＞50%。本研究中0分和1分归为dMMR，≥2分归为pMMR。

1.3随访  采用门诊复诊及微信随访相结合的方式，术后前2年每3个月返院门诊复诊1次，2年后每半年门诊复诊1次，期间不定期进行微信随访。门诊复诊内容包括体格检查、肿瘤标志物（CEA、CA19-9）检查、胸腹部CT扫描，每年1次肠镜检查。微信随访内容主要为问诊及接受患者咨询。截止随访时间为2022年12月31日。随访期间如出现患者死亡则为该病例的随访终点时间。中位随访时间为43个月。

1.4统计学方法  采用SPSS 19.0软件对数据进行分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较用t检验。计数资料使用？字2检验及其较正公式。无病生存期（disease free survival， DFS）和总生存期（overall survival， OS）的生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制，生存曲线的比较采用Log-rank检验。检验水准为α=0.05。

2结果

2.1 MMRP表达情况  190例结直肠癌患者中，pMMR 149例，dMMR 41例，MMRP表达缺失率为21.58%。在dMMR患者中，单纯MLH1表达阴性6例（14.63%），单纯MSH2表达阴性4例（9.76%），单纯MSH6表达阴性5例（12.20%），单纯PMS2表达阴性4例（9.76%），MLH1伴MSH2表达阴性3例（7.32%），MLH1伴MSH6表达阴性2例（4.88%），MLH1伴PMS2表达阴性2例（4.88%），MSH2伴MSH6表达阴性3例（7.32%），MSH2伴PMS2表达阴性1例（2.44%），MSH6伴PMS2表达阴性3例（7.32%），MLH1伴MSH2及MSH6表达阴性2例（4.88%），MLH1伴MSH2及PMS2表达阴性2例（4.88%），MLH1伴MSH6及PMS2表达阴性1例（2.44%），MSH2伴MSH6及PMS2表达阴性2例（4.88%），4种表达均阴性1例（2.44%），见图1。

2.2 MMRP表达情况与肿瘤病理特征关系  不同MMRP表达状态下，肿瘤大小、部位、淋巴结转移、肿瘤病理分期不同，差异有统计学意义（P＜0.05）；dMMR组患者肿瘤最大径更大，多位于右半结肠，但淋巴结转移较少，且病理分期较早。而肿瘤组织学类型、肿瘤分化程度、神经和/或脉管侵犯与MMRP表达状态无关，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.3不同MMRP表达状态与患者预后情况  190例结直肠癌患者中，有26例失访，6例因不同原因不能配合随访，另有12例因非肿瘤相关性疾病而死亡。故将以上部分病例剔除，不纳入与MMRP表达状态与预后关系的研究。截至随访结束，146例患者中，有15例因肿瘤局部复发和/或远处转移而死亡，存活病例中，40例出现肿瘤复发和/或远处转移，该部分患者均有按规范进行辅助化疗，另有91例患者目前未见肿瘤复发和/或远处转移。通过Kaplan-Meier分析显示，dMMR组平均DFS时间为（42.81±1.56）个月，平均OS为（45.14±1.62）个月；pMMR组平均DFS时间为（38.28±0.72）个月，平均OS为（40.75±0.83）个月，患者无病生存時间和总生存时间方面，dMMR患者均优于pMMR患者，差异有统计学意义（？字2=12.814、8.601，P＜0.05），见图2、图3。

3讨论

微卫星是广泛存在于原核及真核生物基因组中具有高度多态性的短串连重复核苷酸序列，其状态与结直肠癌的发生、进展、预后有较为密切相关性，有高度不稳定（microsatellite instability-high， MSI-H）、低度不稳定（microsatellite instability-low， MSI-L）和微卫星稳定（microsatellite stability， MSS）3种状态[9]。MMRP缺失可以引起MSI，从而导致肿瘤发生。在基因复制过程中，MMRP能够将其中出错的DNA碱基进行校正，修复其错配、插入、缺失等行为，使其保持基因复制的准确性，与结直肠癌的发生和进展关系密切[10]。正常情况下，人体出现基因突变导致细胞变异时，MMRP可以及时介导其调亡过程，避免肿瘤的发生。当MMRP自身出现基因突变之后，失去了对出错的碱基进行校正的功能，进而影响到细胞的正常调亡，增加发生恶性肿瘤的风险。

dMMR发生率目前尚缺乏大规模多中心的研究，本研究中dMMR发生率为21.58%，国内外不同学者研究结果显示，MMRP表达缺失率范围在7.8%～34%[11-14]。不同研究间dMMR发生率有较大差异，可能与以下因素有关：①不同人种之间的基因不尽相同，尤其是在基因复制过程中，MMRP的表达存在着差异；②不同生活环境和习惯可以导致MMRP的表达状态不同；③结直肠癌肿瘤组织具有异质性。姜武等[15]认为MMRP的检测及判断有相关标准，但在判读过程中，不同医师主观上的差异，可能使结果存在偏倚。此外，在检测过程中，试剂使用量的误差也可能导致结果出现偏倚。

本研究显示，dMMR结直肠癌患者肿瘤位于右半结肠多于左半结肠，原因考虑跟右半结肠癌与左半结肠癌的分子特征、生物学行为及发病机制存在不同有关。有学者认为[16，17]，右半结肠癌跟MMR缺失、MSI阳性关系更为密切，但发生机制尚未明确。本研究发现dMMR患者中肿瘤最大直径≥5 cm更多见，而肿瘤病理分期中，Ⅰ+Ⅱ期明显多于Ⅲ+Ⅳ期，这提示dMMR患者拥有更早的肿瘤病理分期。在清扫标本中，阳性淋巴结检出率明显少于阴性组，说明肿瘤发生淋巴结转移也较pMMR患者少，与李云凤等[18]的研究结果与一致，认为其原因可能与肿瘤的生物学行为有关，尚须进一步深入研究。通过分析发现，dMMR患者DFS和OS均长于pMMR患者，这与郑紫恒等[19]的研究结果基本相同。其原因与dMMR患者肿瘤病理分期、淋巴结状态有关，更早的肿瘤分期及更少的淋巴结转移使用患者具有更好的预后。在术后辅助治疗方面，冯强等[20]通过研究认为，术后使用卡培他滨联合铂类药物进行辅助化疗，可以使dMMR结直肠癌患者有更好的获益，但本研究未对术后辅助化疗效果进行研究，仍需大量研究来进一步证实。

综上所述，dMMR在结直肠癌中并不少见，而且其与肿瘤的临床及病理特征较为密切，病理分期较早，淋巴结转移较少，预后较好，可以用来预测肿瘤的治疗效果。dMMR与结直肠癌术后辅助化疗疗效的关系及药物的选择将是未来的一个研究方向。

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收稿日期：2023-05-08；修回日期：2023-05-18

编辑/肖婷婷