参仙升脉口服液中挥发性成分及无机元素研究

宗时宇 黄壮壮 张 红 李 晔 刘 峰 刘 洋

(1 陕西省中医药研究院中药研究所,西安,710003; 2 陕西步长制药有限公司,西安,710075)

参仙升脉口服液是用于专门治疗缓慢性心律失常的专利中成药,具有温补心肾,活血化瘀的作用[1]。该复方制剂由8味中药组成,包括红参、淫羊藿、补骨脂(盐炙)、枸杞子、麻黄、细辛、丹参和水蛭[2]。参仙升脉口服液的化学组成十分复杂,既包括难挥发的黄酮类、苷类、醌类和糖类等成分,又包括具有挥发性的小分子化学物质,还含有多种无机元素。中药药效的发挥是基于药物中多种成分综合协同作用的结果[3],但目前研究多仅局限于方中单一中药的化学成分研究[4-5],并不能够体现中药复方的整体性和化学成分的复杂多样性。因此,参仙升脉口服液全方整体化学成分的快速、准确鉴定是一项非常必要又艰巨的工作。

近年来,色谱-质谱联用技术被广泛应用于多种化学成分的高效分析鉴定。课题组前期借助超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术手段,对参仙升脉口服液的化学成分进行了快速有效的辨识,共鉴定出160种化学成分。然而,仅利用单一的技术分析手段,对于挥发性成分和无机元素的检测仍存在一定局限,为了实现对参仙升脉口服液整体化学物质基础的全面、系统的表征,本研究分别采用顶空气相色谱质谱联用(Headspace-Gas Chromatography-Mass Spectrometry,HS-GC-MS)和电感耦合等离子体质谱(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometer,ICP-MS)技术手段,进一步对该复方制剂的挥发性成分和21种无机元素进行分析,为参仙升脉口服液全面的药效物质基础研究及安全性评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 GC-MS气相色谱-质谱联用仪(岛津公司,日本,型号:TQ8040);GC-MS solution色谱工作站和NIST14 LIBRARY数据库(岛津公司,日本);ICP-MS(赛默飞世尔科技有限公司,美国,型号:ICAP-Q);微波消解仪(CEM公司,美国,型号:Mars6);超纯水机(Millipore公司,美国,型号:Mill-Q);电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司,型号:SQP]。

1.2 试剂 浓硝酸(默克公司,德国,货号:PSC01270);DEPC水(赛默飞世尔科技有限公司,美国,货号:R0601);校正液(赛默飞世尔科技有限公司,美国,货号:88323);各无机元素标准液(国家标准物质研究中心);甲醇(赛默飞世尔科技有限公司,美国,货号:A452-4);甲酸(赛默飞世尔科技有限公司,美国,货号:A117-50);水为超纯水。

1.3 分析样品 参仙升脉口服液(山东步长制药股份有限公司,批号:181202)由陕西步长制药有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 基于HS-GC-MS的参仙升脉口服液挥发性物质辨识

2.1.1 检测条件 顶空条件:样品瓶加热温度70 ℃;孵育时间30 min;定量环加热温度80 ℃;吸取样品体积1 mL。GC条件:色谱柱HP-5 ms(60 m×0.25 mm,膜厚0.25 μm);分流比20∶1;柱箱初始温度60 ℃;进样口温度280 ℃;程序升温:初始温度60 ℃,保持1 min,以3 ℃/min速率升至195 ℃,保持5 min,再以5 ℃/min速率升至240 ℃,保持5 min;载气N2;柱流量1.5 mL/min;吹扫流量3 mL/min。MS条件:离子源为EI离子源;离子源温度230 ℃;接口温度260 ℃;溶剂延迟时间4 min;采集时间5～65 min;采集方式为Q1 Scan;间隔0.3 s;扫描范围45～600 m/z。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密量取参仙升脉口服液5 mL,置20 mL顶空进样瓶中,快速压盖密封瓶口,置于顶空自动进样系统AOC-6000,注入色谱仪分析。

2.1.3 数据处理 质谱数据归属利用工作站自带的Nist 4.0数据库进行解析,主要考察基峰和二级碎片离子峰的相似程度,根据Nist 4.0数据库相似性打分选择分值最高的结果作为化合物归属结果,对于打分相同的化合物归属,则根据参仙升脉口服液中构成药材所含有挥发性成分的相关文献报道进行筛选和归属。参仙升脉口服液挥发性成分的GC-MS分析总离子流见图1。通过搜索数据库(美国国家标准与技术研究院,National Institute of Standards and Technology,NIST),共鉴定出29个挥发性成分,并以峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量。结果显示,参仙升脉口服液中相对含量较高的挥发性成分有11个,占所鉴定挥发性成分总量的82.64%。这些成分的量由高到低依次为2-甲基-3-丁烯-2-醇(14.71%)、乙酸(11.66%)、1,2-丁二醇(10.77%)、乙二醇(10.47%)、3,5-二甲氧基甲苯(10.06%)、黄樟醚(7.69%)、α-蒎烯(4.54%)、桉叶油醇(4.35%)、β-蒎烯(3.39%)、优葛缕酮(2.57%)和甲基丁香酚(2.43%)。见表1。

表1 参仙升脉口服液的GC-MS解析结果

图1 参仙升脉口服液GC-MS总离子流

2.2 基于ICP-MS的参仙升脉口服液无机元素分析

2.2.1 检测条件 ICP-MS工作参数:功率13.5 kW,冷却气体积流量15 L/min,载气体积流量0.8 L/min,辅助气体积流量0.94 L/min,样品提升量为1.5 L/min,蠕动泵采集样品转速40 r/min,测量条件为积分时间为10 s,数据采集方式为跳峰,单峰采样点数为3,延迟时间1 s,重复次数3次。采用双蠕动泵管进样,按照检测条件对待测样品进行检验。

2.2.2 标准溶液的制备 精密移取铬(52Cr)、铜(63Cu和65Cu)、砷(75As)、镉(111Cd和114Cd)、汞(202Hg)、铅(208Pb)、铍(9Be)、硼(11B)、钠(23Na)、镁(24Mg)、铝(27Al)、钾(39K)、锰(55Mn)、铁(56Fe)、镍(58Ni)、锌(64Zn)、铷(85Rb)、锶(88Sr)和钡(137Ba)适量的标准溶液,用10%硝酸溶液稀释,配制成含上述21种无机元素质量浓度分别为10 μg/mL的混合对照溶液。精密移取混合标准溶液适量,用10%硝酸溶液稀释,配成含上述各元素质量浓度分别为62.5、125、250、500、1 000 ng/mL的混合对照溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取参仙升脉口服液1.0 mL,置于聚四氟乙烯消解罐中,加入浓硝酸5 mL,密闭消解罐,放入微波消解仪中,按表2消解条件进行微波消解。消解完全后,消解液冷却至60 ℃以下,转入50 mL量瓶中,用DEPC水洗涤消解罐3次,洗液合并于量瓶中,定容至50 mL。

表2 微波消解条件

2.2.4 标准曲线的测定 依照测定条件以浓度为横坐标、峰强度为纵坐标绘制21种无机元素的标准曲线,得到各元素的回归方程,线性关系均较好。见表3。

表3 参仙升脉口服液各待测元素回归方程及含量

2.2.5 供试品的测定 采用ICP-MS对参仙升脉口服液中的21种无机元素进行测定分析,并通过标准曲线计算参仙升脉口服液各待测元素的含量。结果显示,参仙升脉口服液中含有丰富的Na、Mg和K人体必需的常量元素;较高的Fe、Zn、Mn微量元素;少量的Cd、Pb、As、Hg、Cu重金属及有害元素。见表3。

3 讨论

本研究采用HS-GC-MS分析技术,对参仙升脉口服液中的挥发性化学成分进行了快速分析,共鉴定出29个化学成分,这些成分多数来源于药材细辛,个别归属药材红参和麻黄,另有10个成分未找到归属药材。未找到归属药材的成分可能是由口服液制备过程中添加的辅料引入;也存在煎煮、混合等制备工艺过程中,口服液单味或多味组方药材中的化合物之间相互反应而产生的可能性,该类成分可能与药物之间的增溶、助溶等相互作用有关[11-12]。本研究所鉴定出的参仙升脉口服液挥发性成分中,蒎烯具有抗氧化、抗衰老作用[13],桉叶油醇对神经系统具有调节作用[14-15],二者均能提高内皮细胞活力,改善血管内皮的功能状态[16]。甲基丁香酚和黄樟醚是组方药材细辛的主要活性成分,前者为主要有效成分,具有抗炎、降血压和保护神经系统的作用[7];而后者则为主要毒性成分,长期使用可致肝脏毒性[17];然而,也有研究表明,甲基丁香酚也具有一定程度的肝脏毒性[18-19]。课题组前期曾对10个不同产地细辛药材中甲基丁香酚和黄樟醚的含量进行了定量分析与比较,发现2种成分在所检的所有正品细辛中均占有相对较高的含量[20],这可能成为参仙升脉口服液引发潜在不良反应的因素之一。

无机元素尤其是某些微量元素,与中药药效物质的积累及功效的发挥也具有一定的相关性[21],且某些重金属元素含量超限会直接影响中药的用药安全[22-23]。本研究利用ICP-MS对参仙升脉口服液中的21种无机元素进行了定量分析。结果符合2020年版《中华人民共和国药典(四部)》9302“中药有害残留物限量制定指导原则”中的相关要求(As≤2.0 μg/mL,Hg≤0.2 μg/mL,Pb≤5.0 μg/mL,Cd≤0.3 μg/mL,Cu≤20 μg/mL)[24]。有研究显示,缺Zn、Mn可致中医的“肾虚证”[25];具有温理、补气助阳一类功效的中药,Mn含量较高;具有清热、平肝熄风、活血补阳作用的中药,Zn的含量较高;补阳药中Fe、Zn、Mn的含量均较高。本研究结果表明,参仙升脉口服液中Fe、Mn和Zn元素含量在所测元素含量值中均处于较高的水平,这是否与其温补心肾、活血补阳的功效具有一定的相关性,还需要进一步探究。

挥发性成分和无机元素在中药药理活性及临床疗效中发挥重要作用,是中药物质基础全面、系统研究不可或缺的部分,对中医药现代化具有实际意义。本研究结合HS-GC-MS和ICP-MS技术手段,明晰了参仙升脉口服液中的挥发性化学物质基础和无机元素的种类及含量,为后续参仙升脉口服液进一步的药效物质基础研究、质量控制及安全评价体系的提升提供了参考。

利益冲突声明:无。