补肾活血汤经miR-135b改善内异症大鼠子宫内膜容受性的机制研究 *

刘馨竹 祝 佩 崔 英※

（1.江西省妇幼保健院中医科，江西 南昌 330000；2.江西省中西医结合妇科病诊疗中心，江西 南昌 330000；3.江西省中西医结合女性生殖重点研究室，江西 南昌 330000）

子宫内膜异位症（Endometriosis，EMs）是一种子宫内膜组织生长在子宫腔以外的妇科疾病，常引起继发性痛经、慢性盆腔痛和不孕等症。这种疾病常见于育龄妇女，患病率约为10%［1］。该病难以治愈，且治疗后易复发，消耗了大量的社会资源，也给女性身体健康及家庭经济带来巨大的负担。约50%的EMs 患者合并不孕，“EMs 相关性不孕”的概念为国外学者Buyalos 等人于2000 年首次提出，并阐明其是通过多个环节引发不孕的［2］。子宫内膜容受性（Endometrial receptivity，ER）是指子宫内膜对胚胎的接受能力，是影响胚胎着床的关键因素；正常情况下人体内膜在排卵后6～10 d 呈最佳容受状态，这一时期又称“着床窗口期”［3］。EMs 患者内膜在着床窗口期出现的细胞形态改变以及细胞因子、黏附因子和基因的表达异常，降低了ER，从而影响胚胎着床，导致不孕。miR-135b 和HOXA10 mRNA 基因与ER 关系密切。本研究主要通过检测miR-135b 和HOXA10 mRNA基因的表达，探讨EMs对ER的影响机制及补肾活血汤改善EMs相关不孕症患者ER的潜在机制。

1 实验材料

1.1 实验动物年龄70 d左右［平均体质量（270±6）g］的SPF 级SD 雌性大鼠68 只，购于南昌大学医学部实验动物中心，动物许可证号：SYXK（赣）2010-0002。

1.2 主要药物补肾活血汤，由江西省妇幼保健院中药房提供药材；地诺孕素，由德国拜耳医药保健有限公司生产。

2 实验方法

2.1 EMs大鼠分组根据体质量将大鼠编号，采用随机数字表法分为模型组、西药组、中药组、空白正常组和假手术组，各12只；EMs供体组8只。

2.2 EMs大鼠模型的建立将8 只供体大鼠以0.9%水合氯醛腹腔注射，进行麻醉；常规消毒后切除子宫，剪成3 mm×4 mm 大小的子宫碎片，缝合于受体大鼠两侧腹壁及卵巢周围肠系膜血管丰富处，左右各1 块，内膜面朝向腹腔，逐层缝合腹腔；假手术组于两侧腹壁及卵巢周围肠系膜血管丰富处各缝合1 个线结，逐层缝合腹腔。术后大鼠均予青霉素钠注射液腹腔注射10 000 IU。术后5 d腹部切口常规消毒。空白正常组无需处理。

造模1 周后，各组随机选取2 只大鼠检验模型是否成功。若移植组织体积增大，异位病灶内液体积聚，见硬质透明小囊泡，内含淡黄色透明液体，并与周围组织呈不同程度的粘连；卵巢旁异位病灶与周围紧密粘连、不易分离，可形成包裹性积液或血肿；HE 染色后，光镜下见明显的内膜细胞或间质细胞、腺体，视为造模成功。

2.3 给药方法模型建立2 周后给药，5 d 为1 个周期，连续给药3个周期。

2.3.1 中药组予补肾活血汤。组方：桃仁15 g，丹参20 g，白芍15 g，炙甘草9 g，菟丝子10 g，当归10 g，紫河车10 g，川芎10 g，赤芍10 g；用500 mL蒸馏水将以上中药材浸泡30 min，加热沸腾后小火微沸30 min，煎煮两次；将两次药液合并，纱布过滤，水浴锅浓缩至生药含量为1.09 g/mL的中药液，装于无菌小瓶中，4 ℃冰箱保存备用。剂量：109 g/60（kg·d）×6.25=11.35 g/（kg·d）≈0.011 g/（g·d）

2.3.2 西药组予地诺孕素。地诺孕素为白色或类白色片，每片含地诺孕素2 mg。用蒸馏水溶解药片，制成溶液，调整浓度为含地诺孕素0.2 mg/mL 的药液。剂量：2.0 mg/60（kg·d）×6.25=0.21 mg/（kg·d）≈0.0002 mg/（g·d）。

2.3.3 其他模型组、假手术组依据体质量予等量蒸馏水灌胃。

2.4 标本采集各组大鼠着床窗口期采用颈椎脱臼法处死，剖腹，完整取出双侧卵巢和子宫，用小镊子仔细分离并剔除表面的脂肪，0.9% NaCl 注射液冲洗血渍，滤纸吸拭表面，放置于冻存管中，置于-80 ℃冰箱里保存，待检测。

2.5 RT-PCR法检测子宫内膜miR-135b和HOXA10 mRNA表达量取手术切除的各组大鼠一半子宫内膜组织，采用TRIzol 法提取组织总RNA，经紫外分光光度计鉴定，OD 260/280 为1.8～2.1。按TaqMan microRNA 反转录试剂盒说明，将总RNA 反转录为cDNA。以cDNA为模板，按TaqMan Universal PCR Master Mix 试剂盒说明进行PCR 扩增。所有引物由哈尔滨赛拓生物科技有限公司设计合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

PCR 扩增体系（10 μL）：2×TaqMan PCR Mix 5 μL+上下游引物各1 μL+模板cDNA 1 μL+蒸馏水2 μL。

反应条件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共35个循环。

以U6 或GAPDH 为 内 参，采 用2-ΔΔct法 计 算miR-135b、HOXA10 mRNA 相对表达量。实验重复3 次，取平均值。

2.6 统计学方法采用SPSS 22.0 统计学软件分析，计量资料以（±s）表示，行单因素方差分析，组间比较并用邦弗伦尼法；以GraPhpad Prism 9.0 软件作图，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

采用RT-PCR 法检测结果显示，空白正常组和假手术组着床窗口期子宫内膜miR-135b 表达量显著低于模型组、中药组和西药组，中药组显著低于模型组和西药组，差异均有统计学意义（P＜0.001）；空白正常组和假手术组的HOXA10 mRNA 显著高于模型组、中药组和西药组，而中药组和西药组显著高于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.001）。见表2、图1、图2。

图1 miR-135b在各组的表达

图2 HOXA10在各组的表达

表2 各组大鼠着床窗口期子宫内膜miR-135b、HOXA10 mRNA表达比较

4 讨论

EMs 的亚型及导致的疼痛、炎症、盆腔解剖结构改变、粘连、卵巢储备功能紊乱、子宫内膜容受性同疾病的全身影响之间的复杂相互作用，可导致不孕症的发生［4］。研究［5］表明，EMs患者血清及腹腔液中白细胞介素-37（IL-37）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平比正常组显著增高，干扰素-γ（IFN-γ）的分泌显著降低。Bagot C N 等［6］的研究认为，EMs通过降低小鼠HOXA10 mRNA的表达，影响胞饮突的发育从而降低ER。

miR-135 包括miR-135a 和miR-135b 两种亚型，其表达与ER及着床密切相关。在正常子宫内膜和EMs女性的月经周期中，miR-135 表达谱存在显著差异［7，8］。Riyanti A等［9］研究发现，不孕症女性的子宫内膜中miRNA-135b的表达高于能正常生育的对照组1.81 倍（P＜0.01），而HOXA-10 mRNA 的表达显著低于对照组（P=0.047），结论与本研究类似。Petracco R 等［10］研究发现，与正常女性相比，EMs患者增殖期子宫内膜中miR-135a表达显著升高，miR-135b在增殖期和分泌期都有较高表达且变化较小，且该研究还发现HOXA10 mRNA 基因在EMs 患者内膜组织中的表达受到抑制，故提示miR-135 的高表达可抑制子宫内膜中HOXA10 mRNA 的表达，从而影响ER。本研究结果表明，miR-135a在mRNA和蛋白质水平上都抑制了HOXA10 mRNA 的表达，其促进细胞迁移和侵袭的能力被HOXA10 mRNA过表达部分逆转。

中医学认为，血瘀是本病的关键病机，瘀血积聚、肾精化源不足，导致肾虚血瘀；肾虚是基本病机，肾虚则气血运行不畅，血脉瘀积阻滞胞宫，形成肾虚血瘀，故肾虚与血瘀二者互为因果，相互影响［11］。本研究中已造模的三组大鼠着床窗口期子宫内膜miR-135b 表达量显著高于空白正常组和假手术组，HOXA10 mRNA 表达量显著低于空白正常组和假手术组，初步表明EMs 对ER 存在不良影响。中药组大鼠在治疗后子宫内膜miR-135b 表达量比模型组显著下调，HOXA10 mRNA 显著上调（P＜0.05），表明补肾活血汤可通过抑制miR-135b的表达，上调HOXA10 mRNA，从而改善ER。

本研究首次报道了补肾活血可经miR-135b 来改善EMs大鼠ER的机制，对进一步的临床治疗及研究起到一定的启示作用。