血清学检测和基因分型在ABO疑难血型鉴定中的性能评价

关茵,张国平,刘文超,裴垚昶,郭超群

(1.焦作市中心血站 a.血型室;b.业务科,河南 焦作 454000;2.焦作市第二人民医院 输血科,河南 焦作 454000;3.焦作市人民医院 输血科,河南 焦作 454000)

ABO血型系统是一种广泛存在于人类中的遗传现象,常常被用于献血、输血、器官移植等临床操作中[1]。ABO血型系统是判断献血和输血相容性最基本的指标之一[2]。根据ABO血型系统的分类,人群被分为A、B、AB和O型,不同类型之间应该采取不同的献血和输血策略,以避免引起输血反应等不良后果[3]。在基因测序技术出现后,它成为了ABO血型系统分型鉴定的 “金标准”,因为基因测序能够非常准确地揭示ABO基因的遗传信息。同时,利用基因测序技术可以检测到常规检测方法无法检测到的罕见ABO亚型,从而提高检测的准确性[4]。然而,基因测序技术的成本较高,操作难度大,需要专业人员进行操作和解读结果,因此在临床实践中并不是所有情况下都会使用基因测序技术进行ABO血型鉴定[5]。基因分型检测和血清学检测都是常用的血型鉴定方法,不过两种方法的机理不同,因此在某些方面会存在一些差异[6]。为了比较两种检测方法在ABO疑难血型鉴定的差异,本研究通过对106例ABO疑难血型分别进行血清学检测、基因分型检测和基因测序,现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年10月至2022年10月焦作市中心血站进行血型鉴定的106例疑难血型标本(血清格局反应定型表现为弱抗体标本)。血清学格局见表1。(1)纳入标准:①年龄在18周岁以上;②进行血型评估;③入组前6个月内无输血、献血史;④了解研究相关内容及利弊,签署知情同意书。(2)排除标准:①入组前6个月有相关抗血小板等药物使用史;②存在自身凝血功能障碍;③不愿参与研究;④妊娠期妇女。其中,男52例、女54例;年龄23～75岁;平均(48.64±10.85)岁。

表1 血型血清学格局

1.2 检测方法

1.2.1基因测序鉴定ABO疑难血型

采集患者口腔黏膜拭子,从样本中提取出DNA,并进行纯化处理,以消除影响测序结果的杂质和污染物。通过PCR技术特异性扩增ABO基因序列,以获取DNA片段。对PCR扩增所得DNA片段进行高通量测序,可以使用二代测序仪、三代测序仪等设备进行测序。将测序得到的数据与数据库比对,对比对结果进行分析,判断样本中的ABO基因型。抗-H、抗-AB、人ABO反定型用红细胞购自上海血液生物医药有限责任公司;抗-A抗-B试剂购自长春博德生物技术有限责任公司。仪器及试剂盒包括全自动血型分析仪(奥森多公司,型号为AutoVueInnova)、血液基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物技术有限公司)、TaKaRa La Tap酶(日本TaKaRa公司)、DNA琼脂糖凝胶纯化试剂盒(北京TianGen公司)、pMD18-T载体(日本TaKaRa公司))、PCR仪(美国ABI公司)、DNA测序仪(美国ABI公司,型号为PRISM377)、离心机(日本久保田公司,型号为KA-2200)。

1.2.2吸收放散试验

利用抗-A抗-B抗AB血型定型试剂(人血清)进行吸收放散试验,采集被检测者的全血样本,并将其离心分离出红细胞。准备吸收剂:将抗A、抗B、抗AB吸附在已知ABO血型的红细胞上,将其离心沉淀,去除悬浮液。用红细胞洗涤缓冲液对被检测者分离出的红细胞进行洗涤处理。在洗涤后的红细胞中加入吸附剂,反应一定时间后,离心分离,去除上清液。然后,分别用抗A、抗B、抗AB 3种试剂进行血型的鉴定,根据细胞凝集情况判断血型。对于吸收实验结果为疑难血型的样本,可以进行放散实验来进一步确定血型。在吸收放散试验中,通过加入适量的渗透剂,使细胞凝集消失或放散,观察细胞凝集情况,判断血型。

1.2.3实时荧光定量PCR试验

利用人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒检测A、A205、B、O261del、01、01、02等位基因,采集被检测者的全血样本,并将其离心分离出红细胞。将红细胞中的DNA提取出来。PCR反应体系准备:准备PCR反应体系,包括PCR引物、荧光标记探针、Taq聚合酶、dNTPs等。将提取出的DNA加入PCR反应体系中进行反应。PCR条件根据具体实验室的设备和引物可适当调整,常见的反应条件为预变性5 min,95 ℃ 10 min,40个循环(94 ℃ 30 s,60 ℃ 60 s,72 ℃ 30 s),终止延伸72 ℃ 10 min。利用荧光定量PCR设备,检测反应产生的荧光信号。检测结果会显示出被检测样本的基因型信息。根据荧光信号检测结果,将被检测者的基因型信息转化为表型信息,比对参考文献,判断被检测者的ABO血型。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析,计数资料用频数和百分数(%)表示,进行χ2检验;检测方式与金标准结果的差异比较采用配对χ2检验。检测方式与金标准结果的一致性采用Kappa配对检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方式检测结果分析

106例疑难血型标本基因测序结果显示,阳性有46例,阴性有60例。吸收放散试验检测结果中,阳性有48例,阴性有58例;实时荧光定量PCR检测结果中,阳性有47例,阴性有59例。吸收放散试验检测结果、实施荧光定量PCR结果与基因测序检测结果对应,吸收放散试验结果与基因测序结果比较差异无统计学意义(P=0.845>0.05),实时荧光定量PCR结果与基因测序结果比较差异无统计学意义(P>0.999)。见表2。

表2 两种检测方式与基因测序的比较

2.2 两种检测方式与金标准检测结果一致性分析

根据两种检测方式与基因测序(金标准)检测结果的对应情况,进行一致性分析。吸收放散试验结果与基因测序结果呈中度一致性(Kappa=0.503,P<0.001),实时荧光定量PCR结果与基因测序结果的一致性很好(Kappa=0.904,P<0.001)。Kappa值与符合度的关系见表3。

表3 Kappa值的范围与符合度的关系

2.3 两种检测方式诊断效能比较

实时荧光定量PCR方式的诊断准确率、灵敏度、特异度均高于吸收放散试验,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 两种检测方式的诊断效能比较(%)

3 讨论

ABO血型系统是判断献血和输血相容性最基本的指标之一[7]。根据ABO血型系统的分类,人群被分为A、B、AB和O型,不同类型之间应该采取不同的献血和输血策略,以避免引起输血反应等不良后果。然而,ABO血型系统的分型鉴定检查率低可能会导致误诊和漏诊等问题[8-9]。例如,在输血操作中,如果没有正确地区分供者和接受者的ABO血型,就有可能引起输血反应,严重时可能会导致死亡[10]。因此,在临床操作中,对于ABO血型的检查和判定应该严格把关,以确保操作的准确性和安全性。而ABO血型的检查方式便成了其关键。

本研究中,通过对106例ABO疑难血型实施血清学检测(吸收放散实验)等,同时对其实施基因分型检测(荧光定量PCR试验),以基因测序结果为金标准,结果发现血清学检测所得结果与基因测序结果一致性为重度,基因分型检测所得结果与基因测序结果一致性较好。这说明二者都能够提供准确的鉴定结果,这与陈萍等[11]的研究结果相符。这是由于基因分型检测是通过对样本DNA进行PCR扩增,然后使用特异性探针或特异性引物扩增位点来确定基因的亚型[12]。在ABO血型系统中,人体有A、B、O 3种亚型,其中A和 B亚型均由一种转移酶的表达控制,而O亚型则没有转移酶的表达。因此,基因分型检测可以通过扩增ABO基因的关键位点来判断患者所属的血型[13]。血清学检测则是通过将患者的血清和已知血型的红细胞混合反应,观察是否出现凝集或溶解等现象来确定其所属的血型。这种方法利用患者体内产生的抗体与被试血液中表面抗原的结合反应来完成[14]。在ABO血型系统中,如果患者血清中存在对应于红细胞表面A抗原或B抗原的抗体,则当这些抗体分别与被试血液中的A抗原或B抗原相遇时会出现凝集现象,从而确定其血型。因此,二者均可以提供准确的鉴定结果。

通过比较血清学检测和基因分型灵敏度、特异度可知,两种检查方式所得特异度、灵敏度存在较大差异,基因分型灵敏度、特异度更高。这是由于基因分型检测技术对于一些罕见的ABO亚型和变异型的检测能力更强。这些亚型和变异型一般无法通过血清学方法检测出来,但是荧光定量PCR试验可以检测出其特定基因序列,从而进行精确定位和鉴定。

基因分型检测和血清学检测是两种常用的血型鉴定方法,各自具有一些优点和缺点。首先,基因分型检测技术具有高度的准确性和可重复性。基因分型检测是直接检测基因序列来确定血型的,结果不受样本中抗体的影响,并且能够准确地检测出一些罕见的ABO亚型和变异型[15-16]。此外,基因分型检测技术还具有较高的标准化和自动化程度,能够大大降低人为因素和实验误差的干扰。其次,基因分型检测技术更加快速、高效和节约成本。相对于血清学检测需要多次反应和操作,基因分型检测只需要进行1次PCR反应即可获得鉴定结果[17]。并且,基因分型检测的样本准备简单,不需要进行特别处理,相对更加快捷和节省成本。与此相比,血清学检测也有一些优点。例如,在某些情况下,血清学检测能够提供更详细的信息,例如同时检测多种抗体、检测Rh因子等[18-19]。此外,部分医院和实验室可能没有配备基因分型检测设备,而血清学检测设备则普及度更高,更加便于使用。但对于一些疑难血型,由于基因变异、突变等原因,可能导致血清学检测无法准确鉴定血型,此时需要进行基因分型检测。相比于血清学检测,基因分型检测有更高的准确性和可靠性,可以检测出较为罕见的ABO亚型和变异型,并且能够避免人为误差的干扰。

4 结论

虽然基因分型检测和血清学检测有各自的优缺点,但总体上来说,基因分型检测具有更高的准确性和可靠性,更快速、高效且更加节约成本,因此在临床诊断和疾病预防控制中具有广泛的应用前景。