匹莫齐特对脂多糖诱导RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合成酶表达的调控及其作用机制

刘佳

(郑州大学第五附属医院 输血科,河南 郑州 450052)

一氧化氮是机体细胞中参与心血管系统和神经系统信号传导的重要物质[1-3],但是高浓度的一氧化氮能对机体功能造成损伤,也能对线粒体功能损坏并促进细胞凋亡[4-5]。亦有研究表明在严重败血症中,高浓度的一氧化氮会引起机体细胞受损[6]。机体一氧化氮由诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)合成产生,其可引起过氧化亚硝基阴离子水平升高,从而引起了许多炎症疾病的发生[7],因此,抑制机体一氧化氮水平对减轻一氧化氮毒性影响具有重要作用。匹莫齐特(Pimozide)是用于治疗精神分裂症的一种药物,亦是一种常用的多巴胺受体拮抗剂。Nelson等[8]指出Pimozide可抑制信号传导及转录激活因子通路-5信号通路,且同时具有抗白血病的药理作用。鉴于此,本研究人员推测信号传导及转录激活因子通路-5信号通路的拮抗剂对巨噬细胞RAW264.7细胞株诱导型一氧化氮合成酶水平表达也可能具有抑制作用,本实验用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株建立炎症模型[9],以Pimozide作为工具药,探讨信号传导及转录激活因子通路-5信号通路对iNOS水平表达潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞来源

小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株来源于郑州大学医学科学院动物实验室。

1.2 药品与试剂

Pimozide对照品(中国维克奇公司,标准品:HPLC≥98%)LPS(日本三荔公司,批号:AC11974);四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)试剂盒(上海贝万塔生物科技有限公司);蛋白质裂解液试剂盒(上海贝博生物科技公司)、BCA蛋白水平检测试剂盒(北京拜尔迪生物技术有限公司);Griess法试剂盒(中国上海通蔚赛默飞世尔科技公司);巨噬细胞RAW264.7细胞株总RNA提取试剂Trizol、逆转录聚合酶链反应试剂盒(上海通蔚生物有限公司)、DMEM培养基(Cell Signaling Technology,美国);双抗、胎牛血清(南京森贝伽生物科技有限公司)以及SYBR Green实时定量聚合酶链反应试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司);总信号传导及转录激活因子通路-5单抗和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)单抗、磷酸化的信号传导及转录激活因子通路-5单抗(Bioworld,美国);iNOS单抗(Cell Signaling Technology,美国)。

1.3 主要仪器

酶联免疫细胞仪(Bio-Rad,美国),ABI 7500型实时定量荧光聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)仪(Applied Biosystems,美国)。

1.4 细胞培养

用含10%胎牛血清、100 U·mL-1的青链霉素DMEM培养基培养巨噬细胞RAW264.7细胞株,培养条件为37 ℃、5% CO2。

1.5 MTT法检测细胞活性

在96孔板上,收集对数期巨噬细胞RAW264.7细胞株,密度为以1×104每孔。贴壁过夜后,将给予不同浓度(0、2.5、5、10 μmol·L-1)的Pimozide,孵育24 h后,每孔给予浓度为5 g·L-1的MTT溶液,再进行孵育,孵育时间为4 h,去除含胎牛血清的培养液后,给予150 μL的二甲基亚砜(dimethyl surfoxide,DMSO)溶液,用混匀器混匀10 min,然后于紫外分光光度计490 nm波长测定吸光度(optical density,OD)值。

1.6 Griess法检测细胞中一氧化氮水平

参照文献[9-10]以巨噬细胞RAW264.7细胞株浓度为每孔2×105个铺板于24孔微量板中。细胞贴壁过夜,按实验目的分组。即空白对照组、Pimozide对照(10 μmol·L-1)组、脂多糖诱导(1 mg·L-1LPS)组。脂多糖诱导组分为1 mg·L-1LPS、1 mg·L-1LPS+2.5 μmol·L-1的Pimozide、1 mg·L-1LPS+5 μmol·L-1的Pimozide、1 mg·L-1LPS+10 μmol·L-1的Pimozide(在脂多糖诱导前25 min给予Pimozide进行处理)亚组,每组重复3次。孵育24 h后测定不同组巨噬细胞RAW264.7细胞株培养上清液中一氧化氮的水平。一氧化氮的抑制率按如下公式计算:R=100%-(N1-N2)/(N3-N2)×100%,其中R为一氧化氮抑制率,N1为受试组一氧化氮水平,N2为空白对照组一氧化氮水平,N3为脂多糖诱导组一氧化氮水平。

1.7 RT-PCR检测细胞中iNOS mRNA表达

收集巨噬细胞RAW264.7细胞株对数生长期的细胞,以密度为每孔1×106个铺于6孔微量板中,细胞贴壁过夜。按实验要求分组和给药,参见“1.6”方法处理。孵育时间为6 h,参照Trizol法对巨噬细胞RAW264.7细胞总RNA进行获取。获取的RNA在紫外分光光度计下检测后,于RT-PCR分析仪上完成反转录,获取cDNA。合成引物序列如下表[爱必信(上海)生物科技有限公司]。作用条件如下:50 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40个循环。获得的数据采用相对定量的ΔΔCt法进行表示,用iNOS mRNA/GAPDH比值进行评价,并计算iNOS mRNA的抑制率。序列如下:引物序列上游下游iNOS为5’-TCCATGACTCCCAGCACA-3’,5’-CCATCTCCTG-CATTTCTTCC-3’;GAPDH为5’-GGTGAAGGTCG-GTGTGAACG-3’,5’-CTCGCTCCTGGAAGATG-GTG-3’。

1.8 免疫蛋白印迹测定细胞中iNOS、信号传导及转录激活因子通路-5和磷酸化信号传导及转录激活因子通路-5蛋白表达

巨噬细胞RAW264.7细胞株接种同“1.7”,同方法“1.6”给药和分组。利用蛋白质裂解液试剂盒进行细胞内蛋白提取,提取后的蛋白用BCA法进行定量分析。取蛋白25～45 μg加上样缓冲液进行混匀煮沸后,用十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶进行电泳分析。然后转膜,使用5%脱脂奶粉混杂液进行室温封闭1 h,放入相应一抗混合液(iNOS、GAPDH、信号传导及转录激活因子通路-5和磷酸化信号传导及转录激活因子通路-5单抗)进行孵育1 h。洗膜后加入二抗反应1 h。洗去多余抗体及稀释液后开始用试剂盒显影曝光。Quantify One软件用于剖析电泳条带的灰度值。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 Pimozide对巨噬细胞RAW264.7细胞株活性的作用

用0、2.5、5、10 μmol·L-1的Pimozide和/或1 mg·L-1LPS对巨噬细胞RAW264.7细胞进行处理,发现Pimozide和/或LPS均不影响巨噬细胞RAW264.7细胞活性(P>0.05),表明Pimozide和/或LPS对巨噬细胞RAW264.7细胞无显著细胞毒影响(如图1)。所以,本研究以下使用的Pimozide对照浓度为10 μmol·L-1,LPS浓度为1 mg·L-1。

A为空白对照组;B为Pimozide对照组;C为1 mg·L-1 LPS诱导组;D为1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide组;E为1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide组;F为1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide组。

2.2 Pimozide对巨噬细胞RAW264.7细胞中一氧化氮释放的作用

巨噬细胞RAW264.7细胞培养24 h后,空白对照组、Pimozide对照组、LPS诱导组和Pimozide不同浓度组细胞中一氧化氮水平差异有统计学意义(F=25.69,P<0.05);不同浓度Pimozide对巨噬细胞RAW264.7细胞中一氧化氮释放的抑制率相对比值差异有统计学意义(F=132.49,P<0.05)。而与空白对照组相比,LPS诱导组RAW264.7细胞中一氧化氮水平是升高的,差异有统计学意义(P<0.05)。而与LPS诱导组相比,Pimozide中(5 μmol·L-1)、高(10 μmol·L-1)浓度组巨噬细胞RAW264.7细胞中一氧化氮水平下降,差异有统计学意义(P<0.05),见表1和图2。

表1 Pimozide对细胞中一氧化氮释放的影响

#与空白对照组比较,P<0.05;A为空白对照组;B为Pimozide对照组;C为1 mg·L-1 LPS诱导组;D为1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide组;E为1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide组;F为1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide组。

2.3 Pimozide对巨噬细胞RAW264.7细胞中iNOS mRNA和蛋白表达的影响

巨噬细胞RAW264.7细胞培养24 h后,空白对照组、Pimozide对照组、LPS诱导组和Pimozide各浓度组细胞中iNOS mRNA(F=123.59,P<0.05)和蛋白表达差异(F=23.37,P<0.05)有统计学意义。LPS诱导组RAW264.7细胞中iNOSmRNA和蛋白,与空白对照组比较表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。Pimozide中(5 μmol·L-1)、高(10 μmol·L-1)浓度组细胞中iNOS mRNA和蛋白与LPS诱导组比较,表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2和图3、4。

表2 各组巨噬细胞RAW264.7细胞中iNOS mRNA和蛋白表达

#与空白对照组比较,P<0.05;A为空白对照组;B为Pimozide对照组;C为1 mg·L-1 LPS诱导组;D为1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide组;E为1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide组;F为1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide组。

#与空白对照组比较,P<0.05;A为空白对照组;B为Pimozide对照组;C为1 mg·L-1 LPS诱导组;D为1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide组;E为1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide组;F为1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide组。

2.4 Pimozide对巨噬细胞RAW264.7细胞磷酸化的信号传导及转录激活因子通路-5/信号传导及转录激活因子通路-5比值的影响

巨噬细胞RAW264.7细胞对数期培养24 h后,空白对照组、Pimozide对照组、LPS诱导组和Pimozide各浓度组细胞中磷酸化的信号传导及转录激活因子通路-5/信号传导及转录激活因子通路-5表达水平,差异有统计学意义(F=12.07,P<0.05)(如图5)。LPS诱导组细胞与空白对照组相较磷酸化的信号传导及转录激活因子通路-5/信号传导及转录激活因子通路-5比值数增大,而与LPS诱导组相比较,Pimozide中(5 μmol·L-1)、高(10 μmol·L-1)浓度组细胞中磷酸化的信号传导及转录激活因子通路-5/信号传导及转录激活因子通路-5比值数减少,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3和图5。

表3 Pimozide对磷酸化的信号传导及转录激活因子通路-5/信号传导及转录激活因子通路-5比值

#与空白对照组比较,P<0.05;A为空白对照组;B为Pimozide对照组;C为1 mg·L-1 LPS诱导组;D为1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide组;E为1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide组;F为1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide组。

3 讨论

炎症是机体面对损伤的自我保护机制。巨噬细胞是炎症反应中的明星成员,巨噬细胞属免疫细胞,有多种功能:可参与抗原识别和抗原呈递,有效激活免疫细胞应答,分泌炎症递质,形成级联反应。一氧化氮亦是炎症中的关键角色。有研究表明,通过药物干预或者基因敲除等技术能够阻滞一氧化氮的生成,可有效缓解患者或实验动物的炎症反应[11-12]。转录因子活化进程中1个或数个信号转导分子被阻断将导致细胞基因转录受抑[13-14]。为了研究信号传导及转录激活因子通路-5信号通路是否对iNOS的表达具有调节作用,需探索信号传导及转录激活因子通路-5阻滞剂Pimozide对iNOS表达以及一氧化氮合成过程中发挥的具体作用。本实验结果表明,于2.5～10 μmol·L-1之间内的Pimozide,可有效阻滞脂多糖诱导的iNOS蛋白、iNOS mRNA表达以及一氧化氮的释放。

本实验也探讨了Pimozide对磷酸化信号传导及转录激活因子通路-5蛋白表达水平的影响。有资料结果显示,磷酸化信号传导及转录激活因子通路-5蛋白在脂多糖诱导3 h后到达峰值[15],本实验中Pimozide对LPS诱导的磷酸化信号传导及转录激活因子通路-5蛋白水平表达具有阻滞效果。MTT实验结果显示,这种阻滞作用与药物自身的活性相关,而不是通过对巨噬细胞RAW264.7细胞的毒性作用。鉴于氟哌啶醇和利培酮等其他多巴胺受体阻滞剂对iNOS的表达无影响[16],故推测Pimozide对信号传导及转录激活因子通路-5通路的阻滞作用的机制,可能是减少一氧化氮释放。

4 结论

STAT5抑制剂Pimozide可从蛋白和mRNA层面抑制巨噬细胞RAW264.7细胞中脂多糖诱导的iNOS表达,从而减少一氧化氮的释放。阻滞磷酸化信号传导及转录激活因子通路-5蛋白水平的表达,有望成为治疗一氧化氮引起的炎症疾病的新手段,因此为更深入的分子生物学研究,还需要做大量工作。