高效液相色谱法同时测定橘红颗粒中3 种黄酮类成分含量

李 霞，易徐航，杨恢检，熊 毓

（江西省萍乡市食品药品检验所，江西 萍乡 337000）

橘红颗粒为祛痰剂，由化橘红、陈皮、苦杏仁、浙贝母等15味中药组方，有清肺、止咳、化痰功效，可用于治疗痰热咳嗽、痰多、色黄黏稠、胸闷口干等证。组方药材中化橘红、陈皮为祛痰止咳常用药，且均含多种黄酮类成分，其中化橘红主要含柚皮苷、芸香柚皮苷、野漆树苷等成分［1］，陈皮主要含橙皮苷、新橙皮苷、芸香柚皮苷等［2］。黄酮类化合物为最重要的天然低分子量多酚类化合物，以游离态和糖苷的形式广泛分布于植物体内［3］。现代药理学研究表明，化橘红、柚皮苷具有一定的抗氧化［4］及抑制α- 葡萄糖苷酶活性作用［5］，陈皮具有抗炎［3］和抗氧化［6］及抗心肌缺血和保护心脑血管作用［7］。橘红颗粒现收载于2020年版《中国药典（一部）》，但该标准仅对其中陈皮进行了薄层鉴别，采用液相色谱法对浙贝母中的贝母素甲、贝母素乙进行了定性鉴别，并对化橘红中柚皮苷进行了含量测定。且现有报道多仅对制剂中单味药材进行质量鉴别或分析［8-19］，缺乏对橘红颗粒进行全面质量评价的报道。鉴于此，本研究中建立了同时测定橘红颗粒中芸香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷3 种黄酮类成分含量的高效液相色谱（HPLC）法，为全面控制该制剂的质量提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1200 型高效液相色谱仪，含二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；XSR105型、ME204型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度分别为0.01 mg 和0.1 mg）；XMTD-7000型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）。

1.2 试药

橘红颗粒样品（8 批，均为市售产品，编号为S1 -S8，样品信息见表1）。芸香柚皮苷对照品（批号为RF220429 - 06，含量99.68%），柚皮苷对照品（批号为AL210915 - 02，含量98.13%），橙皮苷对照品（批号为PR210902 - 11，含量100%），均购自美国Stanford Chemicals 公司；乙腈、冰醋酸均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent 5TC-C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%醋酸水溶液（B），梯度洗脱（0～15 min 时5%A →20%A，15～45 min 时20%A →30%A，45～60 min 时30%A →100%A，60～65 min 时100%A →5%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

分别称取芸香柚皮苷对照品10.91 mg、柚皮苷对照品13.34 mg 和橙皮苷对照品11.62 mg，加甲醇制成质量浓度分别为0.435 0，0.523 6，0.464 8 mg/ mL 的单一对照品贮备液；分别精密量取适量，置同一容量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为0.043 5，0.052 4，0.046 5 mg/mL的混合对照品溶液。取样品适量，研细，取约1.0 g，精密称定，精密加入甲醇15 mL 使溶解，加热回流30 min，静置，冷却至室温，用甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按橘红颗粒处方及工艺分别制备缺化橘红、陈皮的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备相应的阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验［8］：取2.2 项下4 种溶液各10 μL，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果芸香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷色谱峰峰形对称，与其他杂质峰分离良好，且阴性对照无干扰。详见图1。

线性关系考察：取2.2项下单一对照品贮备液各适量，加甲醇稀释，制成含芸香柚皮苷0.017 4 mg/mL、柚皮苷0.524 0 mg/mL、橙皮苷0.093 0 mg/mL 的混合对照品溶液，分别精密吸取2，4，8，10，12，16，20 μL，按2.1 项下色谱条件进样测定，以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得3种待测成分的回归方程Y1=15.476 27X1+17.935 27（r=0.999 5），Y2= 14.959 32X2+ 205.641 55（r= 0.999 4），Y3=16.097 39X3+63.082 88（r=0.999 7）。结果表明，芸香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷的进样量分别在0.034 8～0.348 μg、1.047～10.47 μg、0.185 9～1.859 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果芸香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷峰面积的RSD分别为0.83%，0.70%，1.00%（n= 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，8，12，16，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果芸香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷峰面积的RSD分别为0.50%，0.45%，0.46%（n=7），表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取样品（批号为220105）适量，共6份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件连续进样测定3次，记录峰面积，并计算样品含量。结果芸香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷的平均含量分别为0.108 0，3.364 2，0.345 6 mg/ g，RSD分别为2.00%，1.99%，1.92%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为220105）约0.5 g，精密称定，各6 份，分别精密加入芸香柚皮苷对照品0.043 5 mg、柚皮苷对照品1.047 2 mg 和橙皮苷对照品0.093 0 mg，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

2.4 样品含量测定

取8 批样品各适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，采用外标法计算各成分含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg/g，n=2）Tab.3 Results of the content determination of three flavonoids in samples（mg / g，n = 2）

3 讨论

3.1 指标成分选择

该制剂中君药化橘红配以陈皮，共奏燥湿化痰之功，两者含有的黄酮类化合物与低分子右旋糖酐作用相似，能促进血液循环，缓解血液淤滞，减少血小板聚集，达到活血化瘀效果。其主要活性成分为黄酮类化合物芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷，故以其作为指标成分进行含量研究。对于本研究结果是否受药材的来源、炮制方法、制剂工艺等影响有待进一步考察。

3.2 试验条件选择

预试验中分别对供试品溶液进行超声和加热回流处理，处理时间分别为10，30，45，60，90 min，结果显示，加热回流提取效果比超声更好，提取30 min 后的含量无显著差异。黄酮苷元难溶于水或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂和稀碱液中，故预试验中提取溶剂分别考察了不同体积分数（20%，40%，70%，100%）的甲醇和乙醇，结果纯甲醇提取效果最好，各指标成分能提取完全。因此本研究中最终选择提取条件为加甲醇加热回流30 min。

3.3 液相色谱条件选择

采用二极管阵列检测器对供试品溶液和对照品溶液在210～400 nm 波长内进行紫外光谱扫描，发现在280 nm 波长处各待测成分响应值较高，同时色谱图基线平稳，噪声小，因此选择280 nm 作为检测波长。预试验中分别以甲醇- 水、乙腈- 水、乙腈- 0.1%醋酸水溶液3 种不同流动相进行梯度洗脱，结果显示，流动相中添加少量的酸有利于改善色谱峰的拖尾及分离度。因此，选用乙腈- 0.1%醋酸水溶液作为流动相，其洗脱效果、各色谱峰峰形、分离度及基线效果均更好。但柚皮苷和橙皮苷保留时间间隔较短，后续仍需进一步优化梯度洗脱条件，以获得更佳的分离效果和灵敏度。

3.4 方法评价

本研究中建立了同时测定制剂中3 种黄酮类成分（芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷）含量的HPLC 法。结果三者含量差异较大，柚皮苷的含量远高于其他2种黄酮类成分。由于各生产厂家投料用的中药材质量存在差异，质量控制方法和手段也不尽相同。因此，建立橘红颗粒多成分含量测定方法对于保证制剂质量安全具有积极意义。