贮藏温度对火棘鲜果采后生理及功效活性成分的影响

陈一龙，商桑，曾顺德，曾小峰，刁源，尹旭敏，高伦江

（重庆市农业科学院农产品加工研究所,重庆 401329）

火棘[Pyrɑcɑnthɑfortuneɑnɑ（mɑxim.）Li]为蔷薇科苹果亚科火棘属常绿野生灌木,别名吉祥果、救兵粮、红子、小红果、红姑娘、火把果和赤阳子等。火棘属植物有10 种,我国发现7 种,常见有4 种,主要分布在我国东南和西南部海拔500～2 800 m 的山地、丘陵地阳坡灌丛草地及河沟路旁,野生资源储量极为丰富,仅重庆地区就达2 万t 左右。火棘果实性味干酸,具有健脾消积、生津止渴、清热解毒、活血止血等功效,在营养保健食品、药品、化妆品、日用品、盆景培植和生态等方面具有诸多作用,综合利用价值高,是亟待开发和利用的野生植物资源[1]。火棘除含有原花青素、黄酮类、酚类、鞣酸类、萜类、生物碱类化合物等多种功效活性成分外,还包含多种微量元素、多种维生素、脂肪酸、蛋白质、胡萝卜素、膳食纤维、淀粉、多糖和果胶等营养成分[2],可开发火棘果粉[3]、饮料[4]、发酵火棘果汁[5]、果酒[6]、果醋[7]、果酱[8]等系列产品。已有研究人员对火棘功效成分如原花青素[9]、黄酮[10]、多酚[11]等的提取工艺和功效活性进行较为系统地研究,发现其具有抗氧化[10]、抗肿瘤[12-13]、预防肝脏疾病[14]、改善高血糖和肠道菌群失调[15]等功效。目前,火棘原料保藏已成为火棘加工企业短板。火棘鲜果传统高温冷库（0 ℃以上）贮藏只能起短期调剂作用,冻藏（-18 ℃）则运行成本过高；干制则易造成火棘原有功效活性成分如原花青素、黄酮、总酚、VC等含量急剧下降,同时也给后续加工带来困扰,如火棘籽油的提取就存在困难。本研究以重庆彭水野生火棘鲜果为试材,分别在-5、-3、-1、1、3、5 ℃贮藏,测定原花青素、黄酮、总酚、VC含量,相关抗性酶[超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、苯丙氨酸解氨酶（shenylalanine ammonia lyase,PAL）]活性、次生代谢产物丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量及腐损率,探究火棘鲜果适宜的贮藏温度,以期为火棘鲜果原料贮藏提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

火棘鲜果:重庆火吉健康产业（集团）有限公司；乙醇（60%）、三氯化铝、乙酸钾、Na2CO3、福林酚试剂、硫酸铁铵、丙酮、甲醇、香草醛、硫酸、草酸、α,α′-联吡啶、VC、十二烷基苯磺酸钠（均为分析纯）、原花青素标品:上海阿拉丁生化科技股份有限公司；芦丁标准品:德国Dr.Ehrenstorfer 公司；没食子酸标准品:天津科密欧化学试剂公司；SOD 活性检测试剂盒、PAL 活性检测试剂盒、丙二醛测试盒、植物类黄酮含量检测试剂盒、植物总酚检测试剂盒:北京索莱宝科技有限公司；2,6-二氯酚靛酚（分析纯）:成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

754E 紫外-可见分光光度计:天津市普瑞斯仪器有限公司；GL-12A 高速冷冻离心机:上海菲恰尔分析仪器有限公司；BC/BD-101HEJ 冰箱:青岛海尔集团有限公司。

1.3 试验设计

试验将采收的火棘鲜果剔除损伤和霉烂果后随机分为6 组,每组250 g,采用打孔聚乙烯（polyethylene,PE）保鲜袋分装,利用冰箱进行控温贮藏,温度波动范围±0.5 ℃,分别置于-5、-3、-1、1、3、5 ℃温度下贮藏,每隔15 d 测定原花青素、黄酮、总酚、Vc、MDA 含量,SOD、PAL 活性和腐损率,做3 次重复。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 原花青素含量测定

取原花青素标品10 mg,用甲醇配制成1.0 mg/mL标准储备液,分别稀释成质量浓度为0.025、0.050、0.100、0.200、0.250、0.500 mg/mL 的标准系列工作液,分别取1 mL 加入2.5 mL 3% 香草醛-甲醇溶液和2.5 mL 30% 硫酸-甲醇溶液,摇匀,30 ℃水浴保温20 min。在546 nm 的波长下测其吸光度,绘制标准曲线（y=0.162x+0.026,R2=0.997 6）。

准确称取1.0 g 火棘鲜果粉末于锥形瓶中,加入乙醇溶液20 mL,将锥形瓶60 ℃水浴60 min,经过滤后提取2 次,合并提取液,旋蒸后用60% 乙醇定容至25 mL。取1 mL 加入2.5 mL 3% 香草醛-甲醇溶液和2.5 mL 30% 硫酸-甲醇溶液,摇匀,30 ℃水浴保温20 min。在546 nm 波长下测其吸光度。

1.4.2 黄酮含量测定

黄酮含量测定参照植物类黄酮含量检测试剂盒说明书。标准曲线的绘制:用移液管分别吸取芦丁标准溶液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mL,置于10 mL 容量瓶中,加入三氯化铝溶液2 mL、乙酸钾溶液3 mL,用乙醇溶液定容至刻度,摇匀,室温下放置30 min,同时以蒸馏水作空白对照,在波长470 nm 处测定吸光度。以吸光度为横坐标,浓度值为纵坐标,绘制标准曲线,得出芦丁浓度（µg/mL）与吸光度间的线性回归方程（y=0.837 7x+0.059,R2=0.990 9）。

生鲜火棘果粉碎,称取样品0.2 g,置于150 mL 具塞三角瓶中,加入乙醇溶液30 mL,盖紧瓶塞,将三角瓶置于65 ℃恒温提取2 h,趁热过滤,滤液置于50 mL容量瓶中,用乙醇溶液清洗滤纸和残渣,合并滤液,冷却至室温,加乙醇溶液至刻度,摇匀,为火棘待测液。准确吸取1.0 mL 火棘待测液至10 mL 容量瓶中,分别加入三氯化铝溶液2 mL、乙酸钾溶液3 mL,用乙醇溶液定容至刻度,摇匀,室温下放置30 min,在4 000 r/min速度下离心10 min,于波长470 nm 处测定吸光度,将其代入标准曲线方程计算黄酮浓度。

1.4.3 总酚含量测定

参照植物总酚检测试剂盒说明书,将生鲜火棘果粉碎,称取样品约0.1 g 于带盖离心管,加入2 mL 60%乙醇水溶液,盖紧,漩涡混匀抽提2～3 min,置于60 ℃提取30 min,4 000 r/min 离心10 min,上清液待测。按说明书测定空白管、标准管、测定管及对照管760 nm下吸光度（A0、A1、A2、A3）,按下列公式计算出植物总酚含量（F,µmol/g）。

式中:B为标准品浓度,500µmol/g；T为提取液体积,0.002 L；X为上清液稀释倍数；Y为样本质量,g。

1.4.4 VC含量测定

参考曹建康等[16]方法测定VC含量。20 g/L 草酸溶液:准确称取草酸20 g,蒸馏水溶解稀释定容至1 000 mL。0.1 mg/mL 抗坏血酸溶液:称取50 mg 抗坏血酸,用20 g/L 草酸溶液溶解,定容至500 mL,低温避光保存。

2,6-二氯酚靛酚溶液:称取2,6-二氯酚靛酚100 mg,充分溶解在100 mL 沸水中（加入26 mg 碳酸氢钠）,冷却后过滤,用蒸馏水定容至1 000 mL,贮于棕色瓶中,低温保存。

2,6-二氯酚靛酚溶液染料标定:采用染料将10 mL 标准抗坏血酸滴定至微红色,15 s 不褪色,根据滴定量计算每mL 染料的滴定度。

称取火棘鲜果10 g 加入少量草酸溶液于研钵中冰浴匀浆,将匀浆转入容量瓶中,加草酸定容至100 mL 摇匀,于冰水静置10 min 后,收集滤液,用移液管移取10 mL 滤液于三角瓶中,用标定后的染料滴定至微红色,且15 s 不褪色即为终点,记录染料用量。以10 mL 草酸溶液为空白对照。按下列公式计算出VC含量（B,mg/100 g）。

B=（V-V0）×T×A/（W× 100）

式中:V为滴定样液时消耗染料溶液的体积,mL；V0为滴定空白时消耗染料溶液的体积,mL；T为2,6-二氯酚靛酚染料滴定度,mg/mL；A为稀释倍数；W为样品质量,g。

1.4.5 SOD 活性测定

参照SOD 活性检测试剂盒说明书进行测定。以每分钟每克样本在反应体系中使560 nm 处吸光度变化0.01 为一个酶活力单位,为U/g（鲜重）。

1.4.6 PAL 活性测定

参照PAL 活性检测试剂盒说明书进行测定。以每分钟每克样本在反应体系中使290 nm 处吸光度变化0.01 为一个酶活力单位,为U/g（鲜重）。

1.4.7 MDA 含量测定

参照丙二醛测试盒说明书进行测定。

1.4.8 腐损率测定

取试样100 g 左右,称量计为m1,分选出褐变、霉烂、黑化的火棘颗粒,称量计为m2,计算腐损率（D,%）。

D=m2/m1× 100

1.5 数据处理

所有数据均平行测定3 次,取平均值,显著性采用SPSS 18.0 软件进行分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 贮藏温度对火棘鲜果功效成分及腐损率的影响

2.1.1 贮藏温度对火棘鲜果原花青素含量的影响

原花青素是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮混合物,具有优越的抗氧化、清除自由基、心血管保护等一系列重要的保健生理作用[17],贮藏期间保持火棘鲜果相对较高的原花青素含量可为深加工提供高品质原料保障。贮藏温度对火棘鲜果原花青素含量的影响如图1 所示。

图1 贮藏温度对火棘鲜果原花青素含量的影响Fig.1 Effects of storage temperature on proanthocyanidin content of fresh pyracantha

由图1 可知,初始原花青素含量为32.11 mg/g。研究发现,贮藏温度越低,越有利于原花青素保持,0 ℃以上贮藏温度随贮藏时间延长原花青素含量下降幅度越大,零下贮藏温度有利于原花青素保持,且贮藏温度越低,下降幅度越小。特别是-3、-5 ℃与常规5 ℃贮藏温度相比,贮藏60 d,-5、-3 ℃原花青素含量分别是其3.80 倍和3.41 倍,比较发现-3 ℃和-5 ℃差异较小,故选择-3 ℃贮藏作为推荐性贮运温度。

2.1.2 贮藏温度对火棘鲜果黄酮含量的影响

黄酮类化合物是一类具有广泛生物活性的物质,具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、防治心血管疾病及增强人体免疫力等多种生物活性。贮藏温度对火棘鲜果黄酮含量的影响如图2 所示。

图2 贮藏温度对火棘鲜果黄酮含量的影响Fig.2 Effects of storage temperature on flavonoid content of fresh pyracantha

由图2 可知,初始黄酮含量为6.11 mg/g。研究发现,贮藏温度越低,越有利于黄酮含量保持,这与顾思彤等[18]研究发现0 ℃贮藏可以显著保持软枣猕猴桃类黄酮含量的结果一致。0 ℃以上贮藏温度随贮藏时间延长,黄酮含量下降幅度越大,而贮藏温度越低,下降幅度越小,零下温度此趋势更明显,-3、-5 ℃效果较好。同5 ℃贮藏相比,-3 ℃黄酮含量是5 ℃的2.17倍,-5 ℃是5 ℃的2.20 倍。比较发现-3 ℃贮藏和-5 ℃贮藏差异不显著,-3 ℃作为推荐性贮藏温度。

2.1.3 贮藏温度对火棘鲜果总酚含量的影响

酚类物质广泛存在于植物中,是植物次生代谢的产物,具有抗氧化、杀菌、清除自由基等作用,同时在预防心脑血管、癌症以及衰老方面有着十分重要的作用[19]。贮藏温度对火棘鲜果总酚含量的影响如图3 所示。

图3 贮藏温度对火棘鲜果总酚含量的影响Fig.3 Effects of storage temperature on total phenolic content of fresh pyracantha

由图3 可知,总酚初始含量高达111.19µmol/g。研究发现,贮藏温度越低,越有利于总酚含量的保持,与张瑜瑜等[20]研究发现蓝莓5 ℃冷藏比对照和0 ℃贮藏更有利于总酚保持结果不一致,原因可能与两者组织结构差异有关；0 ℃以上贮藏温度随贮藏时间延长,总酚含量下降幅度越大,而贮藏温度越低,下降幅度越小,-3、-5 ℃此趋势更明显。同5 ℃相比,-3、-5 ℃总酚含量分别是5 ℃的1.92、1.94 倍。比较发现-3 ℃和-5 ℃差异较小,-3 ℃作为推荐性贮藏温度。

2.1.4 贮藏温度对火棘鲜果VC含量的影响

VC是植物体内的抗氧化物质,具有一定的还原性,可清除果蔬体内因氧化作用产生的自由基,可抑制果蔬体内非酶促褐变。贮藏温度对火棘鲜果VC含量的影响如图4 所示。

图4 贮藏温度对火棘鲜果VC 含量的影响Fig.4 Effects of storage temperature on VC content of fresh pyracantha

由图4 可知,VC初始含量为5.38 mg/100 g。研究发现,贮藏温度越低,越有利于VC保持,这与顾思彤等[18]研究发现0 ℃贮藏显著保持软枣猕猴桃较高VC含量一致。也与曾丽萍等[21]研究发现低温贮藏可延缓VC降解损失一致。0 ℃以上贮藏温度随贮藏时间延长,VC含量下降幅度越大,而贮藏温度越低,下降幅度越小,贮藏60 d,-3、-5 ℃VC保持率分别是5 ℃的3.54、3.58 倍。比较发现-3 ℃和-5 ℃差异不显著,以-3 ℃作为推荐性贮藏温度。

2.2 贮藏温度对火棘鲜果相关抗性酶活性和次生代谢产物的影响

2.2.1 贮藏温度对火棘鲜果SOD 活性的影响

果实在生理代谢过程中产生大量的活性氧,启动膜脂过氧化反应,引起细胞质膜结构破坏。SOD 是细胞抵御活性氧伤害的重要保护性酶,能将O2-歧化为H2O2和O2[22]。贮藏温度对火棘鲜果SOD 活性的影响如表1 所示。

表1 贮藏温度对火棘鲜果SOD 活性的影响Table 1 Effect of storage temperature on SOD activity of fresh pyracantha U/g

火棘鲜果初始SOD 活性为100.04 U/g,由表1 可知,随着贮藏温度升高,SOD 活性逐渐降低。贮藏60 d,-5、-3 ℃和-1 ℃SOD 活性分别是5 ℃的7.3、7.1、5.9 倍,说明贮藏温度越低越有利于维持相对较高的SOD 活性,这与孙佳平等[23]研究发现低温胁迫可造成甜菜SOD 活性显著上升的结果一致。也与赵秋月等[24]发现低温有利于保持平菇相对较高SOD 活性的研究结果一致。

2.2.2 贮藏温度对火棘鲜果PAL 活性的影响

PAL 是苯丙烷类代谢过程关键酶和限速酶,能促进酚类、木质素和植保素等重要抗菌物质合成[25]。贮藏温度对火棘鲜果PAL 活性的影响如表2 所示。

表2 贮藏温度对火棘鲜果PAL 活性的影响Table 2 Effect of storage temperature on PAL activity of fresh pyracantha U/g

低温贮藏有利于维持火棘鲜果较高的PAL 活性,初始PAL 活性为98.07 U/g,由表2 可知,随着温度升高,PAL 活性逐渐降低。说明低温冷藏有利于维持PAL 活性,从而提高抗病性、延缓衰老,低温贮藏有利于维持火棘鲜果较高的PAL 活性,贮藏60 d,-5、-3、-1 ℃的PAL 活性分别是5 ℃的4.07、3.54、2.97 倍。这与秦国政等[26]研究发现拮抗菌与病原菌处理桃并使其导保持较高PAL 活性,有利于发挥抑病效果的结果一致。

2.2.3 贮藏温度对火棘鲜果MDA 含量的影响

MDA 能破坏维持正常代谢的内膜系统,导致细胞透性增加、细胞代谢失调、膜结构及其功能被破坏、果肉组织衰老,其绝对含量和累积速率可作为判断果蔬耐贮性指标之一,MDA 累积含量高低反应细胞膜损伤程度。贮藏温度对火棘鲜果MDA 含量的影响如表3所示。

表3 贮藏温度对火棘鲜果MDA 含量的影响Table 3 Effect of storage temperature on MDA content of fresh pyracantha nmol/g

初始MDA 含量9.22 nmol/g,由表3 可知,贮藏60 d 时,与5 ℃相比,-5 ℃低74.30%,-3 ℃低69.71%,-1 ℃低47.21%,贮藏温度越低越有利于抑制火棘鲜果MDA 累积,这与林炎娟等[27]研究发现低温显著抑制青梅采后MDA 含量积累结果一致。

2.2.4 贮藏温度对火棘鲜果腐损率的影响

贮藏温度是影响采后果蔬呼吸作用、微生物生长和代谢相关酶活性变化的主要因素,贮藏温度对火棘鲜果腐损率的影响如图5 所示。

火棘鲜果主要成分为膳食纤维,由图5 可知,零下贮藏温度不会影响火棘鲜果质构特性,贮藏温度越高,火棘鲜果腐损率越大。5 ℃贮藏60 d,腐损率高达86.82%,3 ℃为75.94%、1 ℃为39.72%,而零下贮藏温度如-1、-3、-5 ℃,其腐损率分别为16.42%、10.47%、10.03%。比较发现-3 ℃和-5 ℃差异不明显,-3 ℃作为推荐性贮藏温度。

3 结论

分析不同贮藏温度、贮藏时间下火棘鲜果功效成分（原花青素、黄酮、总酚、VC）、次生代谢产物MDA 含量、抗性相关酶SOD、PAL 活性和腐损率变化趋势,确定火棘鲜果最适贮藏温度。结果表明,与传统高温冷库贮藏相比,-5、-3、-1 ℃微冻贮藏更有利于火棘鲜果原花青素、黄酮、总酚、VC等功效成分含量的保持,-5、-3 ℃贮藏效果更佳,但整体上-5 ℃和-3 ℃差异不明显；相关抗性酶活性分析表明-5、-3 ℃贮藏有利于维持较高的SOD、PAL 活性,从而提高抗病性、延缓衰老；-5、-3 ℃贮藏可有效降低次生代谢产物MDA 累积程度；-5、-3 ℃腐损率明显降低,-5 ℃和-3 ℃差异不明显。推荐以-3 ℃作为火棘鲜果贮藏温度,可相对减少能耗和运行成本。