超临界CO2萃取石榴籽油及石榴酸甲酯富集

任小娜，李兴梅，吴江超，库尔班江·艾买提

（1.喀什大学生命与地理科学学院,新疆喀什 844000；2.新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室,新疆喀什 844000）

石榴为落叶乔木或灌木,是一种传统的石榴科水果作物[1]。石榴目前在我国已大面积种植。石榴籽是石榴加工业的副产物,约占石榴果实质量的12%[2]。石榴籽中含有丰富的油脂类成分,为15%～20%[3],可进一步加工制得石榴籽油,其油脂中不饱和脂肪酸含量可达90% 多[4],石榴酸含量为64%～83%[5]。石榴酸具有“超级共轭亚油酸”之称,研究表明石榴酸具有抗氧化、调节脂质代谢等功能,有助于预防和治疗肥胖、糖尿病、癌症和心脑血管疾病等病症[6-8]。Kohno 等[9]研究发现石榴籽油可以抑制氧化偶氮甲烷诱导的结肠腺癌的进程,同时可以减少癌的多重性。Gasmi 等[10]研究表明石榴酸是通过抑制细胞中的芳香酶抑制类固醇生成。石榴酸还可抑制雌激素反应性和雌激素非反应性细胞系中的乳腺癌细胞增殖[11]。若将石榴籽油中以甘三酯形式存在的石榴酸转换成单酯,便可通过相关的手段对石榴酸进行富集纯化,还有利于增加其稳定性。

超临界CO2萃取技术具有萃取效率高、安全无毒、萃取剂可以重复使用等优点,且CO2具有化学惰性,能够很好的保护不饱和脂肪酸的活性。尿素包合法根据长碳链脂肪酸的不饱和度实现对不饱和脂肪酸的分离、提纯,其设备简单、条件温和、可有效保护多不饱和脂肪酸的活性,是富集多不饱和脂肪酸的理想方法[12-13]。目前关于超临界CO2萃取石榴籽的研究多集中在萃取工艺的研究和萃取油脂的理化性质分析,伍亚华等[14]研究得到了超临界CO2萃取石榴籽油的最佳工艺,仅对油脂的理化性质和体外抗氧化特性进行了研究。余瑶盼[15]采用分子蒸馏法从石榴籽油中制备高纯度石榴酸乙酯,研究了分子蒸馏法纯化石榴酸乙酯的工艺和乙酯的转化率,制备出高纯度石榴酸乙酯并对石榴酸乙酯的抗氧化活性进行了研究。尿素包合法是近年来应用的分离植物油混合脂肪酸的一个重要研究方法,此法可以按脂肪酸不饱和程度的差异对脂肪酸混合物进行分离,能够比较完整地保留物质的营养和生物活性,可保护双键不受空气氧化。本研究采用超临界CO2萃取技术从石榴籽中提取石榴籽油,对提取油脂的脂肪酸和甘三酯组成和含量进行分析；对商品石榴籽油酯化处理,通过单因素和正交优化试验研究尿素包合法富集石榴酸甲酯的最优工艺,提升石榴酸甲酯的含量,以期为石榴酸甲酯的纯化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜石榴籽:产于新疆喀什；商品石榴籽油:广州合诚三先生物科技有限公司；正己烷、乙腈、异丙醇（均为色谱纯）、尿素、乙醚、石油醚（沸程30～60 ℃）、95% 乙醇、甲醇、酚酞、三氯甲烷、冰乙酸、碘化钾、淀粉、硫代硫酸钠、NaOH、无水Na2SO4（均为分析纯）:天津市鑫铂特化工有限公司。

1.2 仪器与设备

旋转蒸发器（RE-52AA）:上海亚荣生化仪器厂；电子天平（LE204E/02）:梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；比较测色仪（WSL-2）:上海昕瑞仪器仪表有限公司；气相色谱仪（Trace1300）:美国赛默飞世尔科技有限公司；液相色谱-质谱联用仪（1290-6545）:美国安捷伦科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 溶剂萃取法制备石榴籽油

将石榴籽清洗,在30 ℃烘箱中烘36 h,然后破碎,用20 目筛网过滤。采用索氏抽提法,沸程30～60 ℃的石油醚作为溶剂,提取石榴籽油。

1.3.2 超临界CO2法萃取石榴籽油

超临界CO2萃取石榴籽油参照伍亚华等[14]的方法,略加改动:萃取压力30 MPa,萃取温度30 ℃,萃取时间30 min。

1.3.3 脂肪酸组成分析及含量测定

甲酯化方法:参照李桂华[16]的方法进行简易碱式甲酯化。

脂肪酸组成及分析:参考仲雪娜等[17]的气相色谱法。

1.3.4 甘三酯成分及含量测定

将25 mg 的油脂溶解在15 mL 的异丙醇中制备油样,使用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography,HPLC）系统进行分析,并配备四极杆飞行时间质谱仪（quadrupole time of flight mass spectrometer,QToF-MS）。采用Thermo Hypersil Gold 色谱柱（2.1 mm×100 mm,1.9µm）。流动相A 为乙腈/甲醇/水（19∶19∶2,体积比）,流动相B 为异丙醇。

质谱检测器（mass spectrum,MS）设置为正离子ESI模式。气体温度为300 ℃,干燥气体流速为10 L/min,雾化器压力设定为207 kPa,毛细管电压为4 000 V,扫描范围为m/z 200～1 500。采用定性分析B.07.00 系统（Agilent）软件进行数据分析。

1.3.5 石榴籽油理化指标测定

酸值:参考GB 5009.229—2016《食品安全国家标准食品中酸价的测定》。

过氧化值:参考GB 5009.227—2016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》。

色泽:参考GB/T 22460—2008《动植物油脂罗维朋色泽的测定》。

1.3.6 石榴籽油脂肪酸甲酯的制备

称取一定量的商品石榴籽油加入到烧瓶中于60 ℃搅拌预热。然后加入NaOH（油质量的0.5%）和甲醇,在70 ℃回流反应2.5 h。然后将反应物转移至分液漏斗中,静置分层去除下层溶液,将上层溶液用70 ℃蒸馏水多次洗涤至中性,减压旋蒸即可得到石榴籽油脂肪酸甲酯。

1.3.7 尿素包合法富集石榴酸甲酯

以尿素包合温度、包合时间、尿素和95% 乙醇质量比以及尿素和脂肪酸甲酯质量比为单因素,设置单因素试验。称取一定质量的尿素和95% 乙醇于烧瓶中,并在80 ℃下搅拌加热回流溶解尿素。称20 g 石榴籽油脂肪酸甲酯加入到烧瓶中回流1 h。将混合液转移至烧杯中,在特定的温度和时间下进行包合反应。反应结束后,采用减压抽滤分离滤液和尿素包合物。滤液用热水多次洗涤去除尿素和甲醇,最后减压脱水得到富集的石榴酸甲酯。石榴酸甲酯得率（D,%）按照以下公式计算。

式中:m为富集的石榴酸甲酯质量,g；x1为包合后滤液中石榴酸甲酯的含量,%；x2为脂肪酸甲酯中石榴酸甲酯的含量,%。

1.3.8 正交试验

在单因素试验的基础上,以石榴酸甲酯含量为指标,设计L9（34）正交试验对尿素包合工艺进行优化。正交试验因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal optimization experiment

1.4 数据统计

数据采用平均值±标准差表示,显著性分析采用SPSS 18 进行独立样本t检验分析。

2 结果与分析

2.1 石榴籽油的脂肪酸和甘三酯分析

溶剂（石油醚）萃取和超临界CO2萃取喀什甜石榴籽油的主要脂肪酸及其含量见表2。

表2 溶剂萃取法和超临界CO2 法萃取石榴籽的主要脂肪酸组成及含量Table 2 Composition and content of main fatty acids in pomegranate seeds by solvent extraction and supercritical CO2 extraction

由表2 可知,两种萃取方法对石榴籽油的脂肪酸组成影响不大,主要均为石榴酸、亚油酸、油酸、硬脂酸和棕榈酸。两种方法提取的石榴籽油中棕榈酸、硬脂酸的含量差异不显著（P>0.05）,油酸、亚油酸和石榴酸的含量有极显著差异（P<0.01）,石油醚萃取和超临界CO2萃取所得的石榴酸含量分别为61.75% 和71.09%,说明超临界CO2萃取方法可以显著提升油脂中石榴酸的含量,与王林林等[18]的研究结果一致。

超临界CO2提取的石榴籽油的主要理化指标如表3 所示。

表3 超临界CO2 法萃取石榴籽油的主要理化指标Table 3 Main physicochemical indexes of pomegranate seed oil by supercritical CO2 extraction

由表3 可知,超临界CO2提取的石榴籽油酸价符合GB 2716—2018《食品安全国家标准植物油》中对于酸价的要求（≤3 mg/g）,而过氧化值指标略高于对于过氧化值的要求（≤0.25 g/100 g）,这可能是由于超临界CO2提取的石榴籽原油未进行保鲜处理,且其中富含多不饱和脂肪酸,在储藏过程中易发生氧化所致。

超临界CO2法萃取石榴籽油的主要甘三酯组成及含量见表4。

表4 超临界CO2 法萃取石榴籽油的主要甘三酯组成及含量Table 4 Composition and content of main triglycerides in pomegranate seed oil by supercritical CO2 extraction

由表4 可知,共检测出14 种甘三酯,其中PuPuPu含量最高,为19.73%,其次为PuPuS（15.98%）、PuPuO（15.42%）和PuPuL（15.23%）,4 种甘三酯的含量之和为66.36%。石榴籽油中的甘三酯主要以三不饱和脂肪酸甘三酯为主,含量可达52.47%,其次是二不饱和单饱和脂肪酸甘三酯,为41.68%,由于石榴籽油中不饱和脂肪酸含量达到90%以上,因此二饱和单不饱和甘三酯和三饱和甘三酯含量很少,不到10%。

2.2 尿素包合法富集石榴酸甲酯

2.2.1 石榴籽油及其脂肪酸甲酯的脂肪酸组成对比分析

石榴籽油及其脂肪酸甲酯的脂肪酸组成和相对含量见表5。

表5 石榴籽油及其脂肪酸甲酯中脂肪酸组成、含量及甲酯化率Table 5 Composition，content and methyl ester rate of pomegranate seed oil and its fatty acid methyl ester

由表5 可知,甲酯化前后两者的脂肪酸组成一致,对甲酯化前后脂肪酸组成数据采用SPSS 18 进行独立样本t检验分析,石榴籽油和其甲酯化后产品中的各脂肪酸相对含量没有显著差异（P>0.05）,说明本研究采用的甲酯化方法基本上将石榴籽油中的甘三酯完全甲酯化,不会影响石榴籽油中各脂肪酸的相对含量,石榴籽油甲酯可以作为尿素包合法富集石榴酸甲酯的原料。

2.2.2 包合温度对包合反应的影响

包合温度对石榴酸甲酯含量及得率的影响如图1所示。

图1 包合温度对包合反应的影响Fig.1 Effect of inclusion temperature on inclusion reaction

由图1 可知,随着包合温度的升高,石榴酸甲酯的含量和得率均呈现先升高后降低的趋势。石榴酸甲酯的得率在-5 ℃时达到最大,为24.42%。当包合温度太低时会导致尿素迅速结晶,饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸甲酯不能被完全包埋进去。同时,含量高的石榴酸甲酯也可能被尿素晶体夹带,所以在较低的包合温度下石榴酸甲酯的含量降低；包合温度太高时,尿素的结晶量减少,包合反应效果差。在包合温度为5 ℃时,石榴酸甲酯的含量达到最高,为82.14%。综合石榴酸甲酯的含量和得率两个因素考虑,选择包合温度为0、5、10 ℃进行正交优化试验。

2.2.3 尿素和脂肪酸甲酯质量比对包合反应的影响

尿素和脂肪酸甲酯质量比对石榴酸甲酯含量及得率的影响见图2。

图2 尿素和脂肪酸甲酯质量比对包合反应的影响Fig.2 Effect of ratio of urea to methyl ester on inclusion reaction

由图2 可知,随着尿素用量的增加,石榴酸甲酯的含量和得率均呈现出下降的趋势。在尿素和脂肪酸甲酯质量比为0.5∶1 时,石榴酸甲酯的含量和得率最高,分别为78.24%和41.11%,与曹少谦等[19]的研究不同。这可能是因为石榴籽油中饱和脂肪酸的含量低,不足10%,因此包合试验需要的尿素量很少。增加尿素的含量会造成尿素过量,使包合反应容易向逆反应进行,同时,在抽滤时石榴酸甲酯也会被夹带出去,因此得率和含量均呈现降低趋势。因此,选择尿素和脂肪酸甲酯0.3∶1、0.5∶1、1.0∶1 进行正交优化试验。

2.2.4 包合时间对包合反应的影响

包合时间对石榴酸甲酯含量及得率的影响见图3。

图3 包合时间对包合反应的影响Fig.3 Effect of inclusion time on inclusion reaction

由图3 可知,随着包合时间的延长,石榴酸甲酯含量呈现先升高后下降趋势。在包合时间为15 h 时,石榴酸甲酯含量达到最大值,为78.02%。这是因为石榴籽油中石榴酸的含量高,在较短的时间基本上就可以完成对饱和脂肪酸甲酯的包合,若再继续延长包合反应的时间,尿素晶体增加,在抽滤时可能会夹带石榴酸甲酯[20]；包合反应是平衡反应,过长的包合时间也会让反应向解包合反应方向进行,造成石榴酸甲酯的含量和得率的降低。在包合时间为25 h 时,虽然石榴酸甲酯的得率相对较高,但是含量较低,综合考虑,选择包合时间10、15、20 h 进行正交优化试验。

2.2.5 尿素和95%乙醇质量比对包合反应的影响

尿素和95% 乙醇质量比对石榴酸甲酯含量及得率的影响见图4。

图4 尿素和95%乙醇质量比对包合反应的影响Fig.4 Effect of ratio of urea to 95% ethanol on inclusion reaction

由图4 可知,当尿素和95% 乙醇质量比为1∶4时,石榴酸甲酯的含量最高,为79.04%。此时石榴酸甲酯也有较好的得率,为49.90%。这是因为当95%乙醇的用量少时,尿素不能完全溶解,包合效果不好,因混合脂肪酸中石榴酸甲酯的含量较高,在抽滤时尿素晶体也会夹带石榴酸甲酯；当乙醇过量时,尿素浓度偏低,使包合反应向逆反应进行,造成石榴酸甲酯的含量偏低[21]。根据试验结果,综合经济性因素,选择尿素和95%乙醇质量比1∶3、1∶4、1∶5 进行正交优化试验。

2.2.6 正交试验结果

在单因素试验基础上,以石榴酸甲酯含量为考察指标,设计L9（34）正交试验确定最优尿素包合条件。正交试验及结果见表6。

表6 正交试验设计及结果Table 6 Design and results of orthogonal optimization experiment

由表6 可知,4 个影响因素中对试验结果影响最大的是包合时间,其次是尿素与脂肪酸甲酯质量比,再次是包合温度,影响最小的则是尿素与95%乙醇质量比。根据正交试验可知尿素包合试验的最优组合为尿素包合温度为5 ℃,包合时间为20 h,尿素与脂肪酸甲酯的质量比为1.0∶1,尿素和95%乙醇的质量比为1∶5。在最优条件下通过验证试验得到石榴酸甲酯的得率为39.2%,石榴酸甲酯的含量为78.82%,与未包合前相比,石榴酸含量提高了10.06%。余瑶盼等[22]使用分子蒸馏法在最佳的工艺条件下将石榴酸乙酯的含量提高了14.55%,纯度达到95.23%。本研究采用的尿素包合法成本低、操作简单、反应条件温和,但富集后产品中石榴酸甲酯的纯度不如分子蒸馏法。这可能是因为石榴籽油中石榴酸的含量较高,已超过60%,尿素包合法和分子蒸馏的分离原理的差异,导致尿素包合法富集的石榴酸甲酯的纯度不如分子蒸馏法。

3 结论

超临界CO2萃取的石榴籽油的主要脂肪酸组成与有机溶剂（石油醚）萃取和市售商品石榴籽油相一致,但其石榴酸含量为71.09%,高于二者中石榴酸含量,表明超临界CO2萃取技术可以获得石榴酸含量相对高的石榴籽油。在超临界CO2萃取的石榴籽油中检测出14 种甘三酯成分,三不饱和脂肪酸甘三酯占50%以上,其中PuPuPu 含量最高,为19.73%。通过单因素和正交优化试验,对石榴籽油脂肪酸甲酯进行尿素包合富集研究,得到最佳的富集工艺,即尿素包合温度为5 ℃,包合时间为20 h,尿素与脂肪酸甲酯的质量比为1.0∶1,尿素和95%乙醇的质量比为1∶5。在最佳的富集工艺条件下石榴酸甲酯含量为78.82%,提高了10.06%。本研究中尿素包合法操作简单,反应条件温和,但是富集的石榴酸甲酯的得率仍有进一步提升的空间。