荧光定量聚合酶链反应检测脑脊液中结核分枝杆菌DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎的应用价值分析

周冬梅 王洲

【摘要】 目的 探究荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测脑脊液中结核分枝杆菌（mycobacteriumtuberculosis，MTB）DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）的应用价值。方法 选择2019年7月—2021年6月于安陆市普爱医院就诊的存在脑膜刺激征的80例患者作为研究对象，所有患者均经MTB培养后明确诊断，将确诊为TBM的37例患者分入脑膜炎组，疑似TBM的18例患者分入疑似组，非TBM的25例患者分入非TBM组，对3组患者行腰椎穿刺，留取5 mL脑脊液及时送检，分别行MTB培养法、抗酸染色涂片法、荧光定量PCR检测。对比3种检测方法在MTB中的阳性检出率，对比脑膜炎组与疑似组患者MTB的DNA检测数值。结果 脑膜炎组应用荧光定量PCR检测MTB的阳性检出率高于疑似组，差异有统计学意义（P＜0.05）；脑膜炎组与疑似组采用MTB培养法、抗酸染色涂片法的MTB阳性检出率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。脑膜炎组患者MTB的DNA检测数值为（4.71±0.97），疑似组患者MTB的DNA检测数值为（4.35±0.83），2组患者MTB的DNA检测值比较，差异无统计学意义（t=1.351，P=0.183）。结论 应用荧光定量PCR检测脑脊液中MTB的DNA，有助于判断TBM患者病情严重程度，在鉴别诊断TBM中具有较高的临床应用价值，为临床诊疗提供新思路及方向，值得临床推广应用。

【关键词】 结核性脑膜炎；脑脊液；结核分枝杆菌；荧光定量聚合酶链反应

文章编号：1672-1721（2024）04-0127-03     文献标志码：A     中国图书分类号：R446.5

结核性脑膜炎（TBM）是结核分枝杆菌（MTB）经血行或其他途径播散至蛛网膜下腔，对脑膜及脊髓膜造成侵犯的非化脓性炎症疾病。该病发生率约占全身结核疾病的6%，病死率及致残率均较高[1-2]。MTB为兼性细胞内致病菌，可引发进行性疾病或无症状的潜伏感染。初染MTB的3～6个月，TBM发病率较高，极易被临床误诊为化脓性脑膜炎、病毒性脑炎、脑肿瘤等其他脑部疾病[3]。早期准确且快速的诊断对改善TBM患者病情及预后具有重要作用。脑脊液检查是临床诊断MTB DNA的“金标准”。近年来荧光定量聚合酶链反应（PCR）在临床上应用，具有检测速度快、诊断准确度高等特点，可为脑脊液中MTB DNA的鉴别诊断提供可靠的参考依据[4]。鉴于此，本研究采用荧光定量PCR检测脑脊液中MTB的DNA，旨在探究PCR在鉴别诊断TBM的临床应用价值，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年7月—2021年6月于安陆市普爱医院就诊的80例存在脑膜刺激征的患者作为研究对象，男性47例，女性33例；年龄11～68岁，平均（40.09±2.16）岁。所有患者均经MTB培养后明确诊断，将确诊为TBM的37例患者分入脑膜炎组，疑似TBM的18例患者分入疑似组，非TBM的25例患者分入非TBM组（包括9例化脓性脑膜炎、10例病毒性脑膜炎、6例脑部肿瘤）。脑膜炎组男性20例，女性17例；年龄15～65岁，平均（39.94±2.86）岁。疑似组男性8例，女性10例；年龄16～68岁，平均（40.08±2.07）岁。非TBM组男性19例，女性6例；年龄11～66岁，平均（40.11±2.10）岁。3组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），有可比性。

1.2 入选标准

纳入标准：TBM患者均经影像学检查显示大脑外侧裂或基底池中存在渗出物，伴有脑积水或脑回增强，

在脑膜炎病变基础上于脑脊液中可检测到MTB；行脑脊液检测可见蛋白定量升高明显，氯化物、葡萄糖水平较低，皮肤结核菌素试验呈阳性，给予抗结核治疗有效。疑似患者发病时间超过5 d，伴有明显的神志改变，行脑脊液检查可见葡萄糖与脑脊液比值超过0.5，且以淋巴细胞为主；行颅脑磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）及CT扫描可见结果异常，眼底检查异常，伴有其他部位结核。非TBM患者均已明确诊断为化脓性或病毒性脑膜炎及脑部肿瘤。患者及家属均知晓，并签署知情同意书。

排除标准：伴有其他系统恶性肿瘤或转移瘤；其他系统严重疾病；凝血及造血功能异常；其他感染或传染性疾病；意识障碍，无法配合完成本次研究。

1.3 方法

对3组患者行腰椎穿刺，留取5 mL脑脊液及时送检，分别行MTB培养法、抗酸染色涂片法、荧光定量PCR检测。（1）MTB培养法。采用液体培养方式，使细菌与营养物质充分融合接触，促进MTB快速增长，将MTB培养阳性结果作为“金标准”。（2）抗酸染色涂片法。留取脑脊液2 mL，对脑脊液行离心处理，转速12 000 r/min，离心时间15 min，留取沉渣行抗酸染色镜检。（3）荧光定量PCR检测。采用ABI-PCR扩增仪（赛默飞世尔科技公司）进行检测，所有操作均严格遵循试剂盒要求进行。检测时留取500 L脑脊液，对脑脊液行浓缩后取200 L浓缩液，充分震荡混合均匀后行离心处理（转速12 000 r/min，离心时间3 min），离心完毕后去除上层清液，加入1 mL质量分数为0.9%的氯化钠注射液，重悬沉淀，以12 000 r/min转速再次行离心处理，离心时间3 min，去除上层清液后沉淀备用。吸取50 L核酸释放剂，震荡混匀后于室温环境下放置3～5 min，分别吸取36 L PCR反应液、2 L酶结合物、1 L内标液制备成5 L样本液。于94 ℃环境中行预变性5 min，随后于94 ℃环境中持续15 s，57 ℃环境中持续30 s，由此往复行40个循环。结果判定标准：CT值≤39，曲线表现为标准S形，则检测结果判定为阳性；CT值＞39，内标检测呈阳性，则检测结果判定为阴性。

1.4 观察指标

（1）对比3种检测方法在MTB中的阳性检出率。

（2）对比脑膜炎组与疑似组患者MTB的DNA检测数值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件对本次研究数据进行统计学分析，计数资料用百分比表示，行χ2检验，计量资料以x±s表示，行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3种检测方法在MTB中的阳性检出率

脑膜炎组应用荧光定量PCR检测在MTB中的阳性检出率高于疑似组，差异有统计学意义（P＜0.05）；脑膜炎组与疑似组采用MTB培养法、抗酸染色涂片法在MTB阳性检出率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 2组患者MTB DNA检测值对比

脑膜炎组患者MTB DNA检测数值为（4.71±0.97），疑似组患者MTB DNA检测数值为（4.35±0.83）。2组患者MTB DNA检测值对比，差异无统计学意义（t=1.351，P=0.183）。

3 讨论

TBM是MTB引发的以脑膜为主的非化脓性炎症性疾病，该病以脑实质及脑血管受累为主。大量数据显示[5-6]，TBM发病率约占所有活动性结核的1%，是临床上常见的肺外结核性疾病。TBM病情表现较为复杂，行脑脊液检查缺乏典型性，行病原学检查及生化检查缺乏灵敏度及特异度，极易影响临床诊断及治疗[7-8]。选择一种特异性及灵敏度均较高的方法在TBM诊断中具有积极作用。

依据TBM的临床诊断标准，结核性的细菌学检查是诊断TBM的主要依据。既往临床对于结核病的实验室诊断主要采用MTB培养法与抗酸染色涂片法。MTB培养法具有诊断准确度高、结果可靠、特异性高等特点，但所耗费的时间较长，检测通常需要4～8周才出结果，培养过程中仅可培养出活菌，严重影响TBM的诊断及治疗[9]。抗酸染色涂片法具有操作简单、检测速度快、检测费用低等优势，但该方法检测灵敏度及特异度均较差，在临床应用中存在局限性[10]。近年来，荧光定量PCR法因为在临床应用上具有特异性及敏感性高、检测快速等特点，在病原体检测的多个领域得到应用[11]，但荧光定量PCR法对技术要求较高，检测费用较高，推广应用难度较高。本研究结果显示，脑膜炎组应用荧光定量PCR检测在MTB中的阳性检出率高于疑似组，差异有统计学意义（P＜0.05）；脑膜炎组与疑似组采用MTB培养法、抗酸染色涂片法在MTB阳性检出率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；脑膜炎组患者MTB DNA检测数值为（4.71±0.97），疑似组患者MTB DNA检测数值为（4.35±0.83），2组患者MTB DNA检测值对比，差异无统计学意义（t=1.351，P=0.183）。表明相比于MTB培养法及抗酸染色涂片法，荧光定量PCR法在脑脊液MTB DNA检测中具有较高的临床应用价值，阳性检测率较高，可为临床诊疗提供可靠的参考依据。

分析脑脊液MTB DNA检测阴性出现的结果：（1）患者已接受抗结核治疗，或部分患者经由下级医院转入，经不规范治疗后影响阳性检出率的判断；（2）脑脊液中的MTB DNA拷贝数较低，由于TBM疾病早期MTB DNA拷贝数较低，未达到检测试剂的下限，使得阳性检出率较低，出现阴性结果[12]。

综上所述，荧光定量PCR检测脑脊液中MTB DNA在鉴别诊断TBM中具有较高的临床应用价值。该方法无法替代传统检测法作为诊断TBM的金标准，但该方法具有技术成熟等特点，对TBM诊断灵敏度及特异度均较高，可为TBM早期诊断提供更加可靠的参考，值得临床推广应用。

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（编辑：肖宇琦）

作者简介：周冬梅，女，本科，主管技师。