贵州苗族、水族红酸汤滋味与香气差异分析

平洪睿，王亚萍，陈佳妮，王金华

（贵阳学院食品科学与工程学院，贵州贵阳 550005）

贵州人民饮食嗜酸，其中以黔东南地区的苗族红酸汤和黔南地区的水族红酸汤深受各地人民青睐。贵州酸食历史悠久，一方面是因为“地势低洼，水土湿弱，雾露聚集甚多”的地理环境形成的饮食习惯，另一方面是历史上贵州长期盐运困难，劳动人民严重缺盐，形成了“以酸代盐”的饮食文化[1]。苗族红酸汤是以新鲜红辣椒和西红柿为主要原料，经捣碎后放入发酵坛中，加入白酒、米糟、食盐、葱蒜等装坛发酵而成[2]。水族红酸汤是以新鲜红辣椒为原料，去蒂后加入适量的姜、蒜共同粉碎，再加以一定量的白酒、食盐、米糟混匀，装坛发酵而成。发酵后的红酸汤成品色泽鲜红、鲜香酸爽、酸辣醇厚、回味酸甜，含有有机酸、番茄红素、辣椒碱等多种功能性物质，具有抗氧化、防癌、增强免疫力等功效[3-4]。

目前，由于苗族红酸汤的成功商业化，引发广大学者的兴趣，针对苗族红酸汤开展了深入的研究，研究内容集中在菌群鉴定[5]、工艺优化[6]、营养成分[7]以及挥发性风味物质分析[8]等方面。宫路路等[9]通过高通量测序发现，苗族红酸汤的主优势菌为乳杆菌和芽孢杆菌等；张东亚[6]对红酸汤的发酵工艺进行优化，确定了红酸汤的最佳发酵配方；潘季红等[10]的研究显示，有机酸、氨基酸等物质对苗族红酸汤呈特征风味具有重要影响作用。LIU 等[11]分析了红酸汤的挥发性香气物质，共鉴定出42 种挥发性香气物质。LI 等[12]发现苗族红酸汤中含有7 种有机酸、76 种挥发性物质和15 种氨基酸等风味物质。WANG等[13]研究发现不同发酵工艺，红酸汤的风味不同。水族红酸汤是贵州三都县的民族传统食品，以辣椒为主要原料，具有营养丰富、鲜酸纯正、口味地道、微辣不燥、开胃消食、南北皆宜的特点，是贵州独特的酸食文化组成之一，具有极大的商业开发价值。但目前关于水族红酸汤研究较少，因此，本文选用具有典型苗族酸汤特征的凯里县酿三月食品有限公司生产的红酸汤和具有典型水族酸汤特征的三都县红酸汤作为研究对象，采用国标法、氨基酸分析仪、HSSPME-GC-MS 技术等对样品的理化指标、游离氨基酸和挥发性物质进行测定，结合最小偏二乘法和相关性分析建立红酸汤的风味差异和各参数间联系，为贵州不同地域具有代表性的红酸汤品质评估奠定基础，为水族酸汤的商业化开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苗族红酸汤 凯里县酿三月食品有限公司；水族红酸汤 三都县本地农户传统发酵，两种红酸汤均生产于2021 年7 月，发酵时间均为21 d；盐酸、硫酸铜、亚甲蓝、酒石酸钠、氢氧化钠、乙酸锌、冰乙酸、亚铁氰化钾、葡萄糖、石油醚、硫酸钾、硫酸、对硝基苯酚、乙酸钠、乙酸、37 %甲醇、乙酰丙酮、亚铁氰化钾、硼酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺等均为分析纯，天津市密欧化学试剂有限公司。LE204E/02 型电子天平 精度0.0001 g，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；HN-8 数显恒温水浴锅上海力辰帮仪器科技有限公司；101-2AB 电热恒温鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪有限公司；PHS-3CpH 计 上海仪电科学仪器股份有限公司；紫外可见分光光度计 岛津企业管理有限公司；TGL-16A 高速冷冻离心机 湖南平凡科技有限公司；ZXY-48 电热恒温振荡器、；L-8900 型氨基酸分析仪常州金坛良友仪器有限公司；HP6890/5975C GC/MS 气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红酸汤理化成分测定 总酸含量的测定参照GB 12456-2021《食品中总酸的测定》；pH 的测定参照GB 5009.237-2016《食品国家安全标准 食品pH值的测定》；水分含量的测定参照GB 5009.3-2016《食品中水分的测定》；还原糖含量的测定参照GB 5009.7-2016《食品中还原糖的测定；脂肪含量的测定参照GB 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》；蛋白质含量的测定参照GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》；亚硝酸盐含量的测定参照国标GB 5009.33-2016《食品中亚硝酸盐与亚硝酸的测定》。

1.2.2 红酸汤中氨基酸含量测定 参考潘季红等[10]的方法，准确称取1 g 红酸汤样品，用50 mL 0.01 mol/L 的盐酸超声浸提30 min，摇匀后过滤；准确吸取滤液2 mL，加入2 mL 8%的磺基水杨酸，静置15 min 后离心15 min（10000 r/min，10 ℃），取上清液过0.45 μm 滤膜后进氨基酸分析仪分析。

1.2.3 味道强度值 采用味道强度值（TAV）对游离氨基酸对整体滋味的贡献进行评价[14]。计算公式：

式中：C为游离氨基酸的含量（mg/100 g），T为游离氨基酸的的味道阈值（mg/100 g）。

1.2.4 红酸汤中挥发性成分测定

1.2.4.1 挥发性风味物质萃取 准确称取红酸汤样品2.0 g，置于固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex 纤维头的手动进样器，在70 ℃的平板加热条件下顶空萃取60 min 时间后，移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口（温度250 ℃）中，热解析进样。

1.2.4.2 色谱条件 色谱柱：HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，初始温度40 ℃（保留2 min），以3.5 ℃/min 升温至208 ℃，再以10 ℃/min升温至308 ℃（保留3 min），运行时间：63 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压15.98 psi，载气流量1.0 mL/min，分流比5:1，溶剂延迟时间：3 min。

1.2.4.3 质谱条件 离子源为EI 源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压2259 V；接口温度280 ℃；质量范围29～500 amu。

1.2.4.4 定性定量分析 对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist17 和Wiley275标准质谱图，确定了挥发性化学成分，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对质量分数。

1.2.5 相对气味活度值 采用 ROAV 法[15]，对样品总体风味贡献最大的组分 ROAVst=100，其余组分按公式（2）计算：

式中：Ci和 Ti为各挥发物质的相对含量和感觉阈值；Cst和 Tst分别为样品总体风味贡献最大组分的相对含量和感觉阈值。0≤ROAV≤100，ROAV值越大表明该组分对样品总体风味贡献程度越大；以ROAV≥1 的物质确定为样品关键风味物质。

1.2.6 红酸汤感官评定 分别从产品的色泽、滋味、香气、质地等几个方面对红酸汤进行感官评定[16]，各项以百分制评分，每项在综合评分中所占权重分别为：色泽20%，质地20%，滋味30%，香气30%。感官评价标准见表1。评价人员选择食品专业的学生，经一周培训后，筛选10 人组成评价小组（5 男5 女）。评价人员先根据评价标准对酸汤的色泽、质地进行评分，再将酸汤模拟食用情景，以1:15 的质量比进行稀释，煮沸、冷却后对其滋味和香气进行评分。

表1 红酸汤的感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standard of red sour soup

1.3 数据处理

通过Excel 对基本成分和氨基酸数据进行处理，表中均采用均值±标准差表示，从数据库中找到GC/MS 检测到的挥发性物质对应中文名称，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对质量分数。通过利用Origin 2018 软件绘制热图；SPSS 软件进行数据分析，采用T检验进行显著性分析，P<0.05 表示差异显著；SIMCA 14.1 软件用于建立正交偏最小二乘法监督模型（OPLS-DA）。

2 结果与分析

2.1 两种红酸汤理化指标分析结果

总酸、pH、还原糖、脂肪、蛋白质等物质会影响红酸汤的最终呈味[17]。苗族和水族红酸汤样品理化指标分析结果见表2。水族红酸汤中总酸、还原糖、脂肪及蛋白质含量均高于苗族红酸汤，且差异显著（P<0.05）。其中总酸是影响红酸汤酸鲜味的关键因素，也是反映红酸汤品质的重要指标[18]，水族红酸汤的总酸含量（12.29 g/100 g）较苗族红酸汤（7.2 g/100 g）高。还原糖、脂肪和蛋白质在发酵中微生物分解成小分子物质，为非挥发性和挥发性风味物质提供前体物质。

2.2 两种红酸汤游离氨基酸分析结果

游离氨基酸是评价发酵品滋味特征的重要呈味物质，其主要呈现出甜味、苦味、鲜味等滋味特征，不仅能够为滋味物质的形成提供物质基础，还可以与香气物质相互作用产生独特的风味特性[19-20]。由表3 可知，从两种红酸汤中共检测出19 种游离氨基酸，其中包含7 种必需氨基酸，所含游离氨基酸可归为4 类：甜味、苦味、鲜味和无味等[21]。在两种红酸汤中甜味氨基酸总量占比最高（占比55%～60%），其次是苦味氨基酸（占比32%～37%），鲜味氨基酸占比最少；表3 中数据显示，水族红酸汤中总游离氨基酸含量、必需氨基酸含量、各呈味总氨基酸含量均是苗族红酸汤的2 倍。在水族红酸汤中未检测到β-丙氨酸。

表3 苗族和水族红酸汤中氨基酸测定结果及TAV 值Table 3 Results of amino acid determination and TAV value in Miao and Shui red sour soup

游离氨基酸对食品滋味的贡献与氨基酸含量和TAV 值有关，TAV>1，化合物对整体滋味有贡献，且TAV 值越大，贡献越大[22]。从表3 可知，两种红酸汤中丙氨酸和谷氨酸TAV 值>1，说明这两种氨基酸是红酸汤的主要呈味物质，其中苗族红酸汤中丙氨酸的TAV 值高于水族红酸汤，但谷氨酸的TAV 值<1，表明苗族红酸汤在甜味方面较强，而水族红酸汤在鲜味方面较强。此外当丙氨酸与鸟氨酸、丝氨酸、谷氨酸等氨基酸共存时，食品中的鲜味还会增强[23]。虽然苦味氨基酸在游离氨基酸中种类最多，但其TAV值均<1，因此这也就是红酸汤中具有强烈的酸鲜感和回甜味，而未感受到苦味的原因。该实验结果与潘季红等[10]对贵州红酸汤中主要呈味氨基酸分析结果一致。

2.3 两种红酸汤中挥发性物质的测定结果

两种红酸汤样品挥发性成分的定量和定性分析结果见图1 和表4。两种红酸汤中共检测出101 种挥发性物质，共有挥发性物质63 种，其中醇类物质12 种、酯类物质29 种、酸类物质3 种、醛酮类物质3 种、烷烃类物质10 种、酚类物质3 种，醇类、酯类和酸类物质在红酸汤中占比最高。水族红酸汤主要以酯类、醇类、烷烃类为主，苗族红酸汤的挥发性物质以酯类、醇类、酸类为主，且苗族红酸汤中的酸类物质远高于水族红酸汤，主要是山梨酸含量差异较大。

图1 苗族和水族红酸汤离子流图和挥发性物质含量柱状图Fig.1 Hmong and Shui red sour soup ion current diagram and volatile substance content histogram

表4 苗族和水族红酸汤中挥发性物质分析结果Table 4 Analysis results of volatile substances in Miao and Shui red sour soup

醇类物质主要是酵母菌作用产生的代谢物，在发酵初期淀粉糖转化为醇类物质，为有机酸与酯类物质生成提供前体物质，促进风味的形成[24]。苗族红酸汤与水族红酸汤共有醇类物质12 种，占总香气成分（22%～24%）。其中乙醇的含量最高（18%～21%），其次为1-丙醇、苯乙醇以及芳樟醇，这些物质是红酸汤在发酵过程中逐渐形成的高级醇，赋予红酸汤独特的香味。如乙醇提供红酸汤酒香和果香味，也能促进其与其他挥发性风味物质溶解，1-丙醇具有水果、新鲜草木的风味[25]，苯乙醇呈类似玫瑰花香和茉莉花香，使红酸汤的风味更佳柔和、醇香[26]。

酯类物质在发酵中主要通过酸类和醇类物质发生酯化反应生成[27]，是红酸汤中挥发性风味物质最多的种类，占总香气成分的27.5%～35%，其多具有果香气味，高挥发性和低阈值的特点[28]，对红酸汤整体风味贡献较大。十六烷酸乙酯、亚油酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯等是红酸汤的主要酯类物质，而水族红酸汤中酯类物质种类和含量均高于苗族红酸汤，其中具有独特的果香味的乙酸乙酯、己酸乙酯[29]等物质含量差异最为显著。

酸类物质能够赋予红酸汤独特酸鲜味，在发酵中辣椒碱与乳酸菌、醋酸菌发酵等作用下产生的有机酸进行中和，促使发酵后红酸汤整体风味更佳柔和，提高红酸汤的感官品质[30]。由表4 和图1 可知，苗族红酸汤的酸类物质含量（28.09%）占比远高于水族红酸汤（1.92%），主要是苗族红酸汤中山梨酸含量（23.21%）远高于水族红酸汤（0.124%），结合2.1 理化指标分析发现，水族红酸汤总酸含量高于苗族红酸汤。通过观察两种红酸汤的配料表发现，苗族红酸汤中添加有山梨酸钾，而水族红酸汤中未添加，这可能是苗族红酸汤中山梨酸含量高的原因。

含硫化合物、烷烃类物质主要存在水族红酸汤中，苗族红酸汤未检测出含硫化和物。发酵品中含硫化和物主要来源于蛋白质在微生物的作用下降解产生含硫氨基酸（蛋氨酸），含硫氨基酸继续进行Strecker 降解产生含硫化合物[31]。结合理化指标与游离氨基酸分析，水族红酸汤中蛋白质与氨基酸含量明显高于苗族红酸汤，因此水族红酸汤中含硫化物可能主要来源于微生物利用蛋氨酸通过Strecker 降解产生以二烯丙基二硫化物、二-2-丙烯基三硫化物为主的含硫化物。苗族红酸汤中醛酮类物质含量（13.6%）显著高于水族红酸汤（1.06%），其主要以5-环己基-2-戊酮含量最高。酚类物质在两种红酸汤中含量较少。

2.3.1 两种红酸汤挥发性物质的差异性分析 正交偏最小二乘法监督模型（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）可进一步对数据进行可视化分析，进一步挖掘数据之间相关性，同时可以量化特征风味物质造成样品之间差异的程度[32]。如图2（a）～图2（b）所示，本次分析中的自变量拟合指数（R2x）为0.846，因变量拟合指数（R2y）为0.931，模型预测指数（Q2）为0.889，说明模型不存在过拟合，模型验证有效，该结果可用于两地红酸汤香气特征物质的鉴别。利用OPLS-DA 的重要性变量投影（VIP）筛选出关键差异物，VIP 值越大，变量的差异越明显。由图2（c）所示，共筛选出十六酸丙酯、4-乙基-2 甲氧基苯酚、5-环己基-2 戊酮、山梨酸等32 个VIP 值>1 的关键挥发性香气物质，其中酯类、醇类物质对红酸汤香味贡献最大。5-环己基-2-戊酮、山梨酸是苗族红酸汤的主要呈味挥发性物质。己酸乙酯、乙酸乙酯等是水族红酸汤的主要呈味挥发性物质，主要呈水果香味，在发酵中主要通过酸类和醇类物质发生酯化反应生成[28]。乙酸乙酯合成还与其前提合成物质乙酸相关[33]。

图2 苗族、水族红酸汤挥发性物质差异性分析Fig.2 Difference analysis of volatile substances in Miao and Shui red sour soup

2.3.2 两种红酸汤关键挥发性物质ROAV 分析 挥发性物质对红酸汤风味影响取决于各挥发性物质相对含量及阈值大小。故从红酸汤中32 个VIP 值>1的关键挥发性差异物质结合其呈味阈值，进行ROAV 值计算，确定苗族和水族红酸汤的特征风味差异。结果如表5 所示，苗族红酸汤中有乙醇、苯甲醇、水杨酸甲酯、已酸乙酯、丙酸乙酯、丙酸、醋酸等15 种挥发性物质ROAV 值≥1，其中以呈酸味、油脂香、酒香和果香味的丙酸、醋酸、水杨酸甲酯、乙醇和丙酸乙酯的ROAV 值较高；水族红酸汤中乙醇、香叶醇、己酸乙酯、乙酸乙酯、水杨酸甲酯、4-乙基苯酚等11 种挥发性物质ROAV 值≥1，其中呈果香味己酸乙酯、乙酸乙酯，呈脂香和酒香味水杨酸甲酯、4-乙基苯酚的ROAV 值较高。通过ROAV 值发现苗族红酸汤中酸味较水族红酸汤明显，水族红酸汤果香味特征较苗族红酸汤明显，两种红酸汤中脂香均由水杨酸甲酯提供，不同的是两种红酸汤主要呈酒香的挥发性物质不同，苗族红酸汤主要由乙醇提供，而水族红酸汤主要由4-乙基苯酚提供。

表5 苗族和水族红酸汤中挥发性物质相对气味活度值Table 5 Relative odor activity values of volatile substances in Miao and Shui red sour soup

2.3.3 两种红酸汤感官评价结果分析 对苗族和水族红酸汤感官评分结果做雷达图见图3。由图3 可知，水族红酸汤在色泽、口感、质地、香气上均高于苗族红酸汤，并且水族红酸汤的综合评分为92.5 分，苗族红酸汤的综合评分为88.0 分。结合上文对两种红酸汤的理化成分、游离氨基酸和挥发性物质分析，水族红酸汤中总酸、游离氨基酸和挥发性物质等物质含量较苗族红酸汤高，因此赋予了水族红酸汤更好的风味。

图3 苗族和水族红酸汤感官评分雷达图Fig.3 Radar chart of sensory score of Miao and Shui red sour soup

3 结论

苗族和水族红酸汤的理化成分、游离氨基酸和挥发性物质均存在一定差异，水族红酸汤中总酸、还原糖、粗脂肪和蛋白质等均高于苗族红酸汤；两种红酸汤中检测出19 种游离氨基酸，水族红酸汤的呈酸味、甜味、苦味和总游离氨基酸含量均是苗族红酸汤的2 倍，其中丙氨酸、谷氨酸的TAV 值>1，是红酸汤的主要呈味物质；两种红酸汤中共筛选出101 种挥发性物质，苗族红酸汤的挥发性物质以酯类、醇类、酸类为主，水族红酸汤主要以酯类、醇类、烷烃类为主。利用OPLS-DA 的重要性变量投影（VIP）共筛选出十六酸丙酯、4-乙基-2 甲氧基苯酚、5-环己基-2 戊酮、山梨酸等32 个关键差异物。通过ROAV 值发现苗族红酸汤丙酸、醋酸、水杨酸甲酯、乙醇和丙酸乙酯的ROAV 值较高；水族红酸汤中已酸乙酯、乙酸乙酯，呈脂香和酒香味水杨酸甲酯、4-乙基苯酚的ROAV 值较高。可见苗族红酸汤中酸味较水族红酸汤明显，水族红酸汤果香味特征较苗族红酸汤明显；感官评价显示水族红酸汤的感官评分高于苗族酸汤。综上所述，水族红酸汤作为贵州红酸汤的一种，其品质和风味较优，具有很高的市场开发价值。本研究仅对苗族红酸汤和水族红酸汤的基本成分、氨基酸和挥发性风味物质进行了简要对比，接下来本项目组将从两种红酸汤发酵过程中微生物变化对其发酵过程风味的影响以及作用机理展开研究，为贵州红酸汤市场发展提供新的思路。

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