《人源肺癌类器官培养技术规范》（T/SHSYCXH 12-2022）解析

文/许 俊 王萍萍 郭云峰 任 程

肺癌是全球最常见的癌症，也是一种复杂的恶性疾病，在不同患者中表现出的表型和基因型呈多样性，对精准医疗的使用提出了相当大的挑战。由于肺癌是肺上皮细胞的致癌性、遗传学的变化造成的，并且有不同的分子和病理组织学分型，因此，肺癌的突变模式非常复杂。此外，即便是具有相同组织学表型的肺癌也表现出分子生物学上的异质性，并且每种肺癌亚型都具有独特潜在的突变。因此，建立一个模拟原始组织的形态学和基因组特征的临床前模型来预测靶向治疗的临床结果是非常必要的，了解与肺癌的发生、进展和治疗敏感性相关的遗传改变，对于肺癌的治疗意义非凡。

人源肺癌类器官（以下简称“肺癌类器官”）是通过肺癌肿瘤组织在体外进行三维（3D）培养产生的，构建成功率高，且能全面地反映患者肿瘤的形态和遗传/表观遗传特征，与原始临床标本表现出高度的基因型和表型一致性，对抗肿瘤药物表现出模仿患者预期反应的反应，并在短时间内可用。肺癌类器官的培养，可以为药物筛选和研发提供新的高性价比平台，有望缩短新药研发时间，提高新药研发效率。

一、肺类器官培养技术与标准现状

目前，肺类器官根据来源主要分为3种：成熟肺上皮干细胞来源的肺类器官、人类多能干细胞来源的肺类器官和肺癌类器官。肺癌类器官的探索经过了原代肿瘤细胞培养、肿瘤细胞间质细胞混合培养（2D—类器官）和肺癌类器官3个阶段的探索。培养标本来源也从手术和穿刺标本，发展到可以通过循环肿瘤细胞、胸腔积液或支气管肺泡灌洗液培养。肺癌类器官可由患者组织分离出来的肿瘤细胞生成。肺癌类器官培养的实现采用了多种培养方式，包括促人多能干细胞分化、调控原代细胞、肺癌细胞转化和通过“条件重编程”方法增加对肿瘤活检物培养的成功性等。有干性的细胞可以通过荧光激活细胞分选系统或磁珠抗体细胞分选系统进行分离，并在2D培养基或含有基质膜（Matrigel）的3D培养基中进行进一步培养。

肺癌类器官生物样本库的建立，对指导符合人种特性的肺癌治疗和药物研发具有不可替代的意义。具有特殊性肺癌生物样本库的建立，如早期肺癌生物样本库、转移性肺癌样本库和肺癌瘤旁样本库等，有助于研究早期肺癌的演化机制、肺癌的转移特性、肺癌和瘤旁组织的生物学特性等，有助于指导患者的个体化治疗，推动临床前药物研发、肺癌发生、进一步演化和转移的机制研究。

目前，肺癌类器官样本库建设需求旺盛。2020年起，每年涌现出超过50家类器官肿瘤药敏检测服务公司。但是，由于缺乏标准化的肺癌类器官培养方法，各个实验室的试验操作步骤和技术指标要求不同，造成检测结果出现偏差。目前，《人源肺癌类器官培养技术规范》（T/SHSYCXH 12-2022）在基于《肿瘤类器官诊治平台的质量控制标准中国专家共识（2022年版）》（以下简称《肿瘤标准共识》）、《用于药物筛选的人源癌症类器官的建立方法》（以下简称《药物筛选方法》）、相关标准等研究基础上，结合此类器官的特点，反复验证后完成制定，并已发布实施。为进一步推进、规范行业内肺癌类器官培养技术，降低由于试验操作不同而引起的培养结果偏差，助力不同实验室间的数据比对分析，推动肺癌类器官培养技术的发展，扩大其在医学领域的应用范围，本文对T/SHSYCXH 12-2022中的培养关键技术要求展开解析。

二、主要技术要求

T/SHSYCXH 12-2022对医学和研究用途的肺癌类器官的培养所涉及的术语、相关设备、耗材和试剂、伦理要求、操作步骤、技术要求和检测方法等方面进行了规范。

T/SHSYCXH 12-2022涉及的主要技术要求有肺癌类器官的原代培养条件、肺癌类器官的传代培养条件、肺癌类器官的冻存与复苏条件、类器官尺寸、形态学特征、病理标志物表达和基因突变等。

1.肺癌组织样本的获取与运输

肺癌组织样本的获取与运输要求比对见表1。

表1 肺癌组织样本的获取与运输要求比对

如何在最少取样量的同时保证试验效果？肺癌组织样本体积要求的确定是在研究人员对《肿瘤标准共识》和DB4403/T 122-2020（见表1）的研究基础上，经过反复实验验证，最终将肺癌组织样本的取样量确定为＞10 mm3，为成功培养肺癌类器官的最小样本量。

肿瘤组织样本质量的好坏（新鲜度）直接影响类器官培养成功率的高低，故肺癌组织样本的运输温度和运输时间的确定是基于《肿瘤标准共识》中推荐的温度与国外专家推荐的培养温度保持一致，以保证样本质量，降低污染风险。

2.肺癌类器官的原代培养

① 消化温度与消化时间

该指标比对见表2。

表2 肺癌类器官的原代培养消化温度与消化时间指标比对

肺癌类器官的原代培养消化充分，是能够从组织中获得足量细胞的基础。肺癌类器官的原代培养若要消化充分，消化温度与消化时间很关键。本研究的培养温度与DB4403/T 122-2020、《药物筛选方法》一致，且经验证消化温度为此时胶原蛋白酶的最快反应温度，消化时间能够保证组织消化充分。

② 细胞存活率

肺癌组织消化后分离获得的细胞存活率指标，《肿瘤标准共识》要求其细胞存活率通过细胞自动计数仪检测并且应＞90%，《人肠癌类器官》（T/CSCB 0006-2022）团体标准要求其新复苏的类器官存活率应≥50%。经过反复的实验验证，肺癌类器官在消化后细胞存活率只要保持在80%以上，就可成功构建，故TSHSYCXH 12-2022要求细胞存活率指标优于T/CSCB 0006-2022，略低于《肿瘤标准共识》，即消化后的细胞存活率应＞80%。

3.肺癌类器官的传代培养

肺癌类器官的传代培养主要指标见表3。

表3 肺癌类器官的传代培养指标比对

① 肺癌类器官大小

由于过早传代会降低类器官的存活率，因此T/SHSYCXH 12-2022中传代培养的肺癌类器官大小指标的确定是在比对《肿瘤标准共识》与T/CMCB 020-2023相关要求的基础上，并经过验证，确定了可以进行传代培养的类器官平均直径，数值更加精确，要求更高。

② 肺癌类器官的消化时间

若肺癌类器官的消化时间过短，消化会不完全；消化时间过长，则会影响细胞状态。故T/SHSYCXH 12-2022根据DB4403/T 122-2020和《药物筛选方法》，通过比对和反复验证，提出了不同状态下的该类器官的消化时间，以保证类器官状态。

④ 肺癌类器官的传代次数

由于不同来源的癌细胞和组织在培养过程中生长速度存在差异，因此T/SHSYCXH 12-2022在T/CSCB 0006-2022要求基础上，对其中设定的传代次数已进行多次试验验证，即首次进行传代培养的该类器官，应能传代两代以上，且维持生长一个月以上可满足试验需求。

4.肺癌类器官的冻存与复苏后培养

① 人源该类器官的大小

《肿瘤标准共识》要求：一般7 d内可见类器官基本形态，14 d内可见类器官明显生长趋势，被认为状态佳。T/SHSYCXH 12-2022基于表3的相应要求，规定当原代培养的人源该类器官生长至平均直径＞50 μm 时，即可进行传代培养。

② 肺癌类器官的传代次数

T/CSCB 0006-2022要求：从肠癌患者来源的人肠癌组织或细胞，初次在体外培养成人肠癌类器官后，应能在体外维持培养2个月，且应能传代至少3代。由于不同来源的癌细胞和组织在培养过程中的生长速度存在差异，T/SHSYCXH 12-2022设定的传代次数经多次试验验证，可满足试验需求，规定首次进行冻存后，复苏培养的人源该类器官，应能传代2代以上，且维持生长1个月以上。

5.肺癌类器官培养的检测

肺癌类器官培养的形态检测方法的确定是在《肿瘤标准共识》研究的基础上，研究人员提出当肺癌类器官培养2周后的直径＞50 μm，具有持续生长能力。该要求扩展了肺癌类器官培养成功的检测要求，以满足后续的传代与试验需求。

苏木精-伊红染色法常被用于观察正常组织和病变组织的形态结构。肺癌组织表现出的核畸形，细胞质变化应在对应类器官上表现出相同形态。研究人员在经反复验证后，肺癌类器官组织形态学特征和细胞形态学特征鉴定方法采用此染色法。

肺癌类器官病理标志物表达鉴定方法是在《肿瘤标准共识》、T/CSCB 0006-2022和反复试验验证的基础上，研究人员规定了病理表达标志物，并在类器官培养后进行标志物表达鉴定和基因突变检测，以确保类器官的成功培养。

基因突变特征鉴定方法是在T/CSCB 0006-2022的研究基础上确定的，等同采用了该方法。

三、应用展望

T/SHSYCXH 12-2022提供了完备的类器官培养流程和鉴定方法，希望能够有效提高肺癌类器官培养成功率，提升实验室的培养技术，为跨批次、跨实验室和跨平台的技术交流提供一个完善的技术依据，助力我国引领国内外肺癌类器官培养技术，提高国际技术互认。

肺癌类器官的培养是将肺癌分离的组织在特定的3D 培养基里面进行培养，模拟体内实际的肿瘤微环境，进行一系列临床研究。故本文希望该标准能促进生物学和疾病模型等方面的研究，肺癌类器官的培养可用于研究生物学，也可用于模拟治病过程，包括退行性疾病、传染性和遗传性疾病模型。

类器官是接近生理的结构，保留了来源样本的特定功能，并能准确地再现药物反应，故类器官培养技术填补了基于传统细胞系的药物筛选与临床试验之间的空白。T/SHSYCXH 12-2022目前已在国内一些新兴生物医药企业得到应用，为加快肺癌临床药物研究和开发提供了标准支撑。

由于肺癌类器官培养采用人工操作模式，人为因素参与过多、自动化程度低，导致了系统偶然性造成的误差较大，存在可重复性和一致性较差的情况，限制了类器官向临床研究和商业应用转化。本文希望该标准能有助于解决现阶段肺癌类器官培养技术成本高、数据一致性和可重复性差等迫切问题，实现全流程的标准化、智能化、自动化操作，有助于推动肺癌类器官技术商业化应用。

T/SHSYCXH 12-2022提供的肺癌类器官培养流程和检测方法，可以大大提高肺癌类器官的培养成功率，为临床研究提供技术保障。目前，针对肺癌有效的药物较其他癌种多，故在肺癌的耐药机制的探究、耐药后二线用药的选择方面，类器官有很大的发挥空间。同时，肺癌的可治靶点相对较多，结合类器官可以在信号通路方面进一步解读肺癌耐药性，大幅度提高肺癌的诊疗效果，推动精准医学领域的高质量发展。