松果菊苷对动脉粥样硬化血管钙化小鼠Wnt/β-连环蛋白信号通路的影响

袁媛 贾哲睿 王晨皓 刘涛 赵军 何丽娟 陶宁 由淑萍

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）作为心血管病变的重要临床病理变化之一，严重危害人类健康。血管钙化在AS 中普遍存在，目前认为钙化是一个由细胞控制且可主动调节的过程[1]，类似骨发育和骨质疏松的过程，其出现和发展与炎症、脂质堆积、氧化应激等因素有关[2]。在多种信号通路中，Wnt/βcatenin 信号通路在AS 的发生发展中起到了重要的作用。活化的内皮和血管成纤维细胞是AS 进程中骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）等分子产生的主要来源，高表达的BMP-2 引起血管钙化的发生[3]。其中，BMP-2 通过上调成骨转录因子Msx2，促进多种Wnt 配体（如Wnt3a）的产生，减少了内源性抑制剂DKK1 的生成，导致Wnt 信号通路增强[4]。松果菊苷（echinacoside，ECH）是管花肉苁蓉的主要活性成分[5]，具有广泛的药理作用，包含抗氧化应激、抗细胞凋亡及抗炎等[6-8]。近来研究者发现ECH 具有心血管保护活性[9]，本课题组前期研究亦发现此作用[10]。因此，本研究拟探究松果菊苷对AS 血管钙化小鼠Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路的影响，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 实验动物 选择7 周龄健康ApoE-/-雄性小鼠48只，体质量20～22 g，购于江苏集萃药康公司，合格证号：SCXK（新）2018-0003。均于新疆医科大学动物实验中心SPF级条件下饲养。本研究经新疆医科大学动物实验医学伦理委员会审查通过（批准文号：IACUC-20210617-01）。

1.2 药物、试剂与仪器 ECH（纯度≥98%，批号：N25GB168967）购于上海源叶生物科技有限公司；辛伐他汀片（simvastatin tablets，Sta，规格：20 mg/片，国药准字：J20180007）购于美国Merck Sharp 公司；高脂饲料（批号：210709）购于江苏美迪森生物医药有限公司；TC（批号：A111-1-1）、TG（批号：A110-1-1）、HDL-C（批号：A112-1-1）、LDL-C（批号：A112-1-1）测定试剂盒购于南京建成科技有限公司；总RNA 提取试剂盒（total RNA extractor，Trizol，批号：267309）购于美国Invitrogen 公司；PCR 引物合成于上海生工生物工程有限公司；荧光定量（批号：AL51019A）、反转录试剂盒（批号：AL50948A）购于日本Takara 公司；抗鼠/兔通用型免疫组化试剂盒（批号：20030278）、Wnt3a（批号：26744-1-AP）、β-catenin（批号：17565-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批号：10494-1-AP）兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 抗体（批号：20000373）购于武汉三鹰生物技术有限公司；LRP5（批号：85c5505）兔单克隆抗体购于美国Affinity 公司；BMP-2（批号：R01213885）购于沈阳万类生物科技有限公司；RIPA 裂解液（批号：2020928）、蛋白酶抑制剂（批号：20210927）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（批号：20210901）购于北京索莱宝科技有限公司；ECL 显色液（批号：22346507）购于Biosharp 公司；Eclipse Ni-U 显微镜购于日本Nikon 公司；移液器、低温离心机（型号：5424R）购于德国Eppendorf 公司；全波长功能酶标仪（型号：Multiskan GO）、荧光定量PCR 仪（型号：ABI QuantStudio 6Flex）购于购于美国Thermo Fisher 公司；全自动紫外线分光光度计（型号：ND2000）购于北京基因有限公司；电泳和转膜装置（型号：Cavoy PowerPac HC+Mini-PR）购于上海臻诺生物科技有限公司；凝胶成像仪（型号：Cel-DocXR）购于美国Bio-rad 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与处理 根据参考文献[11]通过基因打靶技术制备小鼠AS 模型。将小鼠经过1 周的适应性喂养后采用随机数字表法分为6组，每组8只：分别为模型组、ECH 12.5、25、50 mg/kg 组、Sta 组和对照组。ECH 12.5、25、50 mg/kg 组和Sta 组给予高脂饲料造模（含19.97%的无水乳脂，0.15%的胆固醇），对照组给予基础饲料。从高脂饮食喂养的第1天开始，模型组、对照组每日灌胃相同体积的0.5%羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）溶液，ECH 各剂量组及Sta组每日按设定剂量灌胃给予ECH或Sta，连续给药16周后处死小鼠，进行血清收集及主动脉取材。

1.3.2 检测标本采集 造模末日小鼠禁食不禁水12 h后摘除眼球取血，置于EP 管内。然后断颈处死并打开腹腔，取出主动脉放入装有4%多聚甲醛液的离心管中固定48 h。

1.3.3 小鼠主动脉组织病理检查 将固定的小鼠主动脉脱水透明后用石蜡包埋，蜡块切成厚度为5 μm的组织切片并迅速固定在载玻片上，常规的HE 染色后在显微镜下观察并比较6 组小鼠主动脉的形态学变化。

1.3.4 小鼠血清生化检测 将EP 管内的血液以3 000 r/min，4 ℃离心30 min，吸出上清液分装新的EP管内，采用磷酸甘油氧化酶法测定TG 水平，采用胆固醇氧化酶法测定小鼠血清TC 水平，酶标仪直接法测定LDL-C 和HDL-C 水平。

1.3.5 小鼠主动脉β-catenin mRNA 的表达测定 采用实时荧光定量PCR 法，用含Trizol 的溶液提取小鼠主动脉的总RNA 后纯化（达到A260/A280=1.8～2.0）。采用反转录试剂盒合成cDNA，取1 μL 产物进行扩增，10 μL 反应体系，扩增条件为：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 个循环，重复3 次。PCR 运行结束后读取CT 值，以2-ΔΔCt法分析β-catenin mRNA 的相对表达水平。引物序列：GAPDH：F（5'-GGTTGTCTCCTGCGACTT-CA-3'），GAPDH：R（5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'），β-catenin：F（5'-GCTGCTGTCCTATTCCGAATG- TCTG-3'），β-catenin：R（5'-GGCACCAATGTCCAGTCCAAGATC-3'）。

1.3.6 小鼠主动脉相关蛋白表达测定 采用Western blot 法检测β-catenin、Wnt3a、LDL 受体相关蛋白5（LDL receptor protein，LRP5）及BMP-2 蛋白表达水平。从-80 ℃冰箱中取冻存的小鼠主动脉组织放入预冷的研磨管内，根据称取的量加入一定比例裂解液，使用全自动样品快速研磨仪进行组织研磨，冰浴裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min，离心15 min取上清液。根据BCA 法检测总蛋白浓度；加入5 倍的上样缓冲液混匀后，100 ℃水浴加热变性10 min；于10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳（电压120 V，60 min），将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜上，300 mA 恒流电转70 min。5%脱脂奶粉于室温下封闭聚偏二氟乙烯膜2 h，进行一抗（β-catenin，1∶4 000、Wnt3a，1∶1 000、LRP5，1∶1 000、BMP-2，1∶1 000、GAPDH，1∶10 000）4 ℃下孵育过夜，清洗3 次后室温下孵育二抗1 h。凝胶成像仪拍照显色，分析条带灰度值。βcatenin、Wnt3a、LRP5 及BMP-2 蛋白表达水平=目的条带灰度值/内参条带灰度值×100%。

1.3.7 小鼠主动脉LRP5 蛋白表达测定 采用免疫组化法，组织包埋切片后，70 ℃烤片2 h，二甲苯和梯度乙醇进行脱蜡至水后放入pH=9.0 的抗原修复液微波修复15 min，自然冷却至室温，以3%H2O2阻断过氧化物酶，FBS 孵育，加入一抗，浓度为1∶50，4 ℃孵育过夜，加入二抗，37 ℃孵育30 min，滴加二氨基联苯胺显色，苏木素复染后采用盐酸乙醇分化，PBS 返蓝，自然晾干后用树胶封片，显微镜下观察切片并拍照保存。采用Image-pro-plus6.0 进行图像分析，以平均光密度值分析LRP5 蛋白表达水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 26.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6 组小鼠主动脉组织形态学变化比较 模型组和ECH 12.5 mg/kg 组小鼠主动脉管腔壁厚度不均，内膜增厚明显，局部发生严重钙化，斑块明显突向管腔，组织弹力纤维排列紊乱，并伴有炎性细胞浸润。ECH 25、50 mg/kg 组及Sta 组中膜较模型组明显变薄，弹力纤维排列整齐，斑块明显缩小，对照组小鼠血管结构排列正常，主动脉内壁未发现明显的平滑肌细胞增生，管腔未见胆固醇结晶形成，见图1。

图1 6 组小鼠主动脉组织形态学变化的比较（A：模型组；B：ECH 12.5 mg/kg 组；C：ECH 25 mg/kg 组；D：ECH 50 mg/kg 组；E：Sta 组；F：对照组）

2.2 6 组小鼠血生化指标的比较 6 组小鼠的血生化指标比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01），其中模型组小鼠的TG、TC 及LDL-C 水平均高于对照组，HDLC 水平低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01），ECH 25、50 mg/kg 组和Sta 组TG 水平均低于模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；ECH 12.5、25、50 mg/kg 组和Sta 组TC 水平均低于模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；ECH 12.5、25、50 mg/kg 组和Sta 组LDL-C 水平均低于模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；ECH 12.5、25、50 mg/kg 组和Sta 组HDLC 水平均高于模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.001），见表1。

表1 6 组小鼠血生化指标的比较

2.3 6 组小鼠主动脉β-catenin mRNA 的比较 6 组小鼠主动脉β-catenin mRNA 表达水平分别为2.01±0.11、1.68±0.05、1.35±0.07、1.01±0.06、0.86±0.05、0.82±0.03，差异有统计学意义（F=188.925，P＜0.001）。其中模型组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。ECH 12.5、25、50 mg/kg 组及Sta 组均低于模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.4 6 组小鼠主动脉相关蛋白表达水平的比较 6 组小鼠主动脉相关蛋白表达水平差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中模型组小鼠主动脉β-catenin、Wnt3a、LRP5 及BMP-2 蛋白表达水平高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01），ECH 25、50 mg/kg 组小鼠主动脉β-catenin、Wnt3a、LRP5 及BMP-2 蛋白表达水平均低于模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；Sta 组小鼠主动脉β-catenin、Wnt3a、LRP5 及BMP-2 蛋白表达水平亦低于模型组，差异均有统计学意义（t=24.334、12.108、17.506、22.536，均P＜0.05），见表2 和图2。

表2 6 组小鼠主动脉相关蛋白表达水平的比较

图2 6 组小鼠主动脉相关蛋白表达的电泳图

2.5 6 组小鼠主动脉LRP5 蛋白表达水平的比较 6 组小鼠主动脉LRP5 蛋白表达水平分别为0.35±0.01、0.25±0.03、0.17±0.03、0.15±0.02、0.16±0.03、0.07±0.01，差异有统计学意义（F=96.536，P＜0.001）。其中模型组小鼠高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。ECH 12.5、25、50 mg/kg 组及Sta 组均低于模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.001），免疫组化检测结果见图3。

图3 6 组小鼠主动脉LRP5 蛋白表达免疫组化检测所见（A：模型组；B：ECH 12.5 mg/kg 组；C：ECH 25 mg/kg 组；D：ECH 50 mg/kg组；E：Sta 组；F：对照组）

3 讨论

血管钙化被认为是AS 的自然进展过程，在临床上是AS 的标志。而目前对血管钙化的防治效果不尽人意，因此探索新的血管钙化防治药物尤为重要。ECH在心血管等方面的药理作用得到了广泛关注，如具有清除自由基损伤、抗炎及免疫调节等生物活性。

脂质代谢紊乱对AS 的发生与发展起决定性作用，血清中氧化型LDL（oxidized low density lipoprotein，OXLDL）的升高，HDL-C 降低，易于沉积在血管壁上，逐步演化为斑块，最终导致AS 发生，因此对血脂水平的有效调控是预防AS 的重点工作，但是AS 发生后并不止步于此，血管平滑肌细胞中BMP-2 的大量表达激活了Wnt 信号通路并驱动成骨程序，加速了AS 血管钙化的进一步发展。

本研究所采用的小鼠因其血脂代谢功能存在异常，可诱发多余的脂质在血管内堆积，从而自发形成动AS 斑块，通过高脂饲养可加快其血管内斑块的形成。HE 结果显示，模型组和ECH 12.5 mg/kg 组小鼠主动脉管腔壁厚度不均，内膜增厚明显，局部发生严重钙化，斑块明显突向管腔，组织弹力纤维排列紊乱，并伴有炎性细胞。ECH 25、50 mg/kg 组及Sta 组中膜较模型组明显变薄，弹力纤维排列整齐，斑块明显缩小，对照组小鼠血管结构排列正常，主动脉内壁未发现明显的平滑肌细胞增生，管腔未见胆固醇结晶形成，表明中、高剂量的ECH 对小鼠主动脉有一定的保护作用。经过ECH 干预之后，血清中TG、TC、LDL-C 表达水平低于模型组，HDL-C 表达水平高于模型组，提示ECH干预后能显著逆转AS 的脂质异常。以上结果显示，随给药物浓度的增加，ECH 的作用效果增加，且呈现出剂量依赖的关系，其中ECH 25、50 mg/kg 组对AS 小鼠有明显的保护作用。

Wnt 信号通路在血管钙化中的作用及其调控机制受到人们的广泛关注，参与细胞增殖、分化、迁徙和侵袭[12-14]，Wnt3a、LRP5 和β-catenin 在已经发生钙化的主动脉瓣中有较高的表达[15]，因此抑制该信号通路能够达到阻碍成骨细胞增殖和分化，降低成骨细胞矿化活性。本研究中，模型组小鼠主动脉β-catenin mRNA 表达水平高于对照组；ECH 12.5、25、50 mg/kg 组及Sta 组β-catenin 的mRNA 表达低于模型组，提示ECH 可以通过下调β-catenin 的表达来缓解AS 化造成的斑块沉积。在蛋白表达测定中模型组小鼠主动脉β-catenin、Wnt3a、LRP5 及BMP-2 蛋白的表达水平高于对照组，ECH 25、50 mg/kg 组小鼠主动脉β-catenin、Wnt3a、LRP5 及BMP-2 蛋白的表达水平低于模型组，随着剂量的增加，小鼠主动脉Wnt3a、β-catenin 及LRP5 蛋白相对表达量呈逐步降低趋势，提示ECH 可以通过下调β-catenin、Wnt3a、LRP5 及BMP-2 的表达来缓解血管钙化的发生发展。有研究表明Wnt 信号细胞膜外的Wnt相关配体（如Wnt3a）与低密度脂蛋白受体蛋白5/6、跨膜受体卷曲蛋白相结合，经过细胞质内的蓬乱蛋白与酪蛋白激酶1-α 进行信号传递，激活了由轴蛋白/结肠腺瘤性蛋白/糖原合成酶激酶3β 结合物，从而促使细胞质内聚集了大量β-catenin 且与T 细胞转录因子/淋巴增强因子结合后形成复合体，进一步激活了下游靶基因，从而促进转录和成骨细胞凋亡，减缓血管钙化的产物[16-17]。由此推测ECH 可能通过抑制Wnt 信号通路中的β-catenin、Wnt3a 与LRP5 从而对小鼠AS血管钙化有一定改善作用。

综上所述，本研究证明ECH 对小鼠AS 硬化血管钙化具有一定的保护作用，可能与其抑制Wnt3a信号通路胞外Wnt3a与LRP5相关蛋白形成的受体复合物的结合有关，从而为AS血管钙化的防控提供新的治疗药物。