肿瘤坏死因子受体3 相互作用蛋白2与心房颤动相关性的临床研究

耿金 李涛 李伟 袁国良 王丙剑 章延春

随着人口的老龄化以及心血管疾病患者的增多，心房颤动（下称房颤）的发病率日益升高，其致死、致残率较高，极大影响患者的生活质量及生存率，同时增加家庭、社会的经济负担[1-2]。目前认为房颤是一种慢性炎症性疾病，以心房纤维化为主要特点，伴随心房电活动和结构的紊乱。尽管关于房颤的研究很多，但其具体发病机制仍不详，临床中也缺乏有效的生物学标志物来预测其发病风险。肿瘤坏死因子受体3 相互作用蛋白2（tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 interacting protein 2，TRAF3IP2）调节多种炎症因子信号通路，在动脉粥样硬化以及易损斑块的形成中发挥重要作用[3]。近来有研究表明，TRAF3IP2 在小鼠心肌肥大和缺血再灌注模型中与心肌纤维化有因果关系[4-5]。本研究旨在探讨TRAF3IP2 与房颤的相关性，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2021 年6 至12 月南京医科大学附属淮安第一医院收治的瓣膜性心脏病患者41 例，其中男17 例，女24 例，年龄40～76（58.68±10.70）岁。根据是否合并房颤，分为房颤组（22 例）和非房颤组（19 例）；其中有8 例患者转至心脏外科行瓣膜置换或修复手术，房颤患者5 例，非房颤患者3 例。入选标准：（1）心脏彩超明确诊断为瓣膜性心脏病；（2）纽约心脏病协会（New York Heart Association，NYHA）心功能分级Ⅱ～Ⅲ级；（3）年龄＜80 岁。排除标准：（1）急性左心衰竭、心功能Ⅳ级；（2）重症感染和活动性风湿热；（3）甲状腺功能紊乱；（4）严重的肾功能不全；（5）病态窦房结综合征或其他需要起搏器治疗的情况；（6）阵发性房颤。本研究经南京医科大学附属淮安第一医院伦理委员会批准，所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 心脏超声检查 采用荷兰飞利浦公司Epic7 彩超仪对所有患者行心脏彩超检查，在入院3 d 内完成，记录左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimeter，LVEDd）、左心房直径（left atrial dimeter，LAD）和左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.2.2 全血TRAF3IP2 表达水平检测 所有患者入院当天抽取静脉血5 mL。采用DNA 提取试剂盒（中国凯基，KGA1206）按照说明书提取全血DNA，简单步骤如下：全血RNA 以Trizol 试剂提取并以NanoDrop 2000 分光光度计定量。1 μg 的RNA 以cDNA 第一链合成试剂盒反转录为DNA。定量PCR 在Stepone Plus Real-Time PCR system 仪器（美国Bio-Rad）上进行。DNA 的表达水平以2-ΔΔCt法分析。PCR 引物序列如下：GAPDH 正义链，5'-AGAACATCATCCCTGCCTCTACT-3'，反义链，5'-GATGTCATCATATTTGGCAGGTT-3'；TRAF3IP2正义链，5'- ACCGTGATGATAATCGTAGCAATC -3'，反义链，5'-CTGTAGACATGAGTGTTCTGAAGC3 -3'。TRAF3IP2 结果以2-ΔΔCt表示。

1.2.3 心房肌组织TRAF3IP2 表达水平检测 8 例患者手术过程中在左心耳的适当部位取少许心房肌组织，-80 ℃冰箱保存行后续检测。采用免疫组化法，心房肌组织标本以甲醛固定，无水乙醇脱水后制备石蜡切片。石蜡切片脱水后，以2%胎牛血清孵育30 min，以TRAF3IP2 一抗（美国Santa Cruze，sc-398161）4 ℃孵育过夜。PBS 冲洗后，以二抗孵育30 min，并以苏木精复染细胞核5 min，脱水后封片。TRAF3IP2 的表达水平采用Image Pro Plus 软件以整合光密度值分析。

1.2.4 心房肌组织胶原含量检测 标本同1.2.3，采用马松染色，按照试剂盒（中国凯基，KGMST-8004）说明书进行，简单步骤如下：石蜡切片脱水后以蒸馏水清洗，以苏木精染核5 min，充分水洗后以丽春红染色液染色5 min，冰醋酸溶液和磷钼酸溶液清洗后，以苯胺蓝染色液染色5 min，脱水后封片。采用Image Pro Plus 软件分析心房肌组织胶原含量，评估其纤维化程度。

1.2.5 心房肌组织TRAF3IP、α 平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）蛋白表达水平检测 标本同1.2.3，采用Western blotting 法。以全蛋白提取试剂盒（中国凯基，KGP250）提取组织蛋白，BCA 法定量蛋白浓度。在配好的胶中加入蛋白样品后电泳，然后转膜至PVDF 膜上。脱脂牛奶封闭该膜后以TRAF3IP2一抗（美国Santa Cruze，sc-398161）和α-SMA 一抗（美国Santa Cruze，sc-32313）4 ℃孵育过夜，以二抗孵育30 min 后ECL 法显影，以GAPDH（美国Santa Cruze，sc-47724）作为参照蛋白。采用Image J 软件定量分析TRAF3IP、α-SMA 蛋白表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0 分析软件。正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用非参数检验。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher 精确检验。对LAD 进行分层分析，采用Spearman 直线相关法分析TRAF3IP2 与LAD 的相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较 两组患者年龄、性别、伴随疾病、LVEDd、LVEF 及生化指标等比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。房颤组LAD、LAD＞3.5 mm的比例及TRAF3IP2 表达水平均大于非房颤组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见表1。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 LAD 与TRAF3IP2 表达水平的相关性分析和分层分析 相关性分析显示，LAD 与TRAF3IP2 表达水平呈直线相关（r=0.33，P=0.037），见图1。分层分析显示，LAD＜3.5 mm 者及LAD＞3.5 mm 者中，房颤患者的TRAF3IP2 表达水平均高于非房颤患者（均P＜0.01），见表2。

图1 LAD 与TRAF3IP2 表达水平相关性分析的散点图

表2 不同LAD 患者TRAF3IP2 表达水平比较

2.3 两组患者心房肌组织胶原含量和TRAF3IP2、α-SMA 蛋白表达水平比较 8 例患者于心脏外科行瓣膜置换术或修复术，其中非房颤组3 例，房颤组5 例。马松染色显示房颤组心房肌组织胶原含量高于非房颤组（P＜0.01），免疫组化染色显示房颤组心房肌组织TRAF3IP2 蛋白表达水平高于非房颤组（P＜0.01），见图2A、B。Western blotting 法显示房颤组左心房组织的TRAF3IP2 和α-SMA 蛋白表达水平均高于非房颤组（均P＜0.01），见图2C、D。

3 讨论

TRAF3IP2 是位于细胞质内的衔接蛋白，能直接与TNF-α、IL-1 等结合，通过激活其下游的JNK 和NF-κB 通路调节炎症因子的合成与分泌、参与多种疾病的发生、发展，目前关于TRAF3IP2 的研究多在动物和细胞模型中进行。部分研究表明，TRAF3IP2在动脉粥样硬化以及易损斑块的形成中发挥重要作用[3]，其潜在机制可能是通过TRAF3IP2 参与泡沫细胞的形成、诱导内皮细胞功能障碍和促进平滑肌细胞迁移、增殖[6-8]。近期，Sakamuri 等[4]以醛固酮皮下注射小鼠构建心肌肥大模型，发现心肌的TRAF3IP2表达水平明显升高，抑制TRAF3IP2 的表达后小鼠心肌肥大的程度减轻，同时心肌纤维化的程度也得到了抑制。在小鼠缺血再灌注模型中，心肌TRAF3IP2的表达水平同样明显升高，而敲除TRAF3IP2 基因后，小鼠心肌梗死面积以及纤维化程度均明显减少[5]。进一步的研究表明，TRAF3IP2 通过JNK 通路调节成纤维细胞的增殖与迁移，且促进其分泌各型胶原最终诱导纤维化[9]。这些动物和细胞的研究结果均表明，TRAF3IP2 作为一种炎症相关蛋白，广泛参与了动脉粥样硬化、心肌重构和心肌纤维化的发生、发展。TRAF3IP2 在人体中同样广泛表达，但健康状态表达量较低，病理状态下表达则明显升高[10]。目前尚缺乏TRAF3IP2 与人类心血管疾病相关性的研究数据。

心房肌纤维化是心房颤动的主要特征之一，因此TRAF3IP2 可能参与房颤进展。为验证该假说，本研究入选瓣膜病房颤患者，发现房颤患者的TRAF3IP2表达水平较非房颤患者明显升高，此外，TRAF3IP2 表达水平与患者LAD 呈直线相关，由于房颤患者的左心房显著大于非房颤患者，因此行分层分析以校正其对结果的影响。最终发现TRAF3IP2 表达水平与房颤的相关性不受左心房大小的影响。有部分患者行外科手术，术中取其左心耳心房肌组织行马松染色、免疫组化及Western blotting，发现房颤患者心房肌组织的TRAF3IP2 表达水平和纤维化程度高于非房颤患者，这些结果表明TRAF3IP2 表达水平可能与心房肌的纤维化相关，进而参与房颤的进展。根据本研究的结论，推测在房颤发展过程中TRAF3IP2 通过调节心肌纤维化参与房颤的进展，但尚需进一步的研究证实。

本研究在临床标本中证实TRAF3IP2 与房颤存在相关性，但由于样本量较小，且并未行动物以及细胞实验明确TRAF3IP2 与房颤的因果关系，因此仍需更多的临床以及基础研究证实本结论。