香豆素通过调控组蛋白去甲基化酶3 和骨髓分化蛋白2 改善脓毒症相关AKI的机制研究

金光军 赵金凯 徐步海 张建成 潘旭鸣 季明霞

脓毒症是由微生物感染引起的播散性炎症反应，易引发脓毒症相关急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）[1]。目前，AKI 除 透 析 外 没 有 更 好 的 治 疗干预措施，因此，迫切需要新的治疗干预措施来阻止或缓解AKI 的发生、发展。香豆素（scoparone，Sco）是来自中药地肤中的一种活性物质，在多种疾病中显示出抗炎、抗氧化作用。如Sco 可以改善非酒精性脂肪性肝炎小鼠的肝脏炎症和自噬[2]，还能抑制IL-1β 诱导软骨细胞中诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶2 的表达，从而减轻软骨细胞的炎症反应[3]。此外，Sco 还通过抑制Ras 相关C3 肉毒毒素底物1 介导的氧化应激来减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大和炎症反应[4]。但Sco 对AKI 的作用机制尚未阐明。组蛋白去甲基化 酶3（jumonji domain-containing protein 3，JMJD3）和骨髓分化蛋白2（myeloid differentiation protein-2，MD-2）均是脓毒症中起促炎作用的关键分子，但JMJD3 与MD-2 在AKI 中的具体作用有待进一步阐明。本研究拟通过体内外实验探究Sco 对脓毒症相关AKI 的作用，同时对Sco 治疗脓毒症相关AKI的机制进行阐释，旨在为治疗脓毒症相关AKI 的新药研发提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物及细胞 6～8 周龄C57BL6 雄性小鼠24只购自杭州医学院实验动物中心，许可证号：SYXK（浙）2019-0011。所有小鼠饲养在SPF 级动物房，正式实验前小鼠适应性饲养1 周。本实验经浙江省实验动物中心实验动物福利伦理委员会审查通过（批准文号：ZJCLA-IACUC-20020102）。人肾小管上皮细胞系HK-2（批号：BNCC339833）来自北京北纳创联生物科技有限公司。

1.2 试剂及仪器 小鼠血肌酐（serum creatinine，Scr）（批号：ml037726）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）（批号：ml076479）均购自上海酶联生物科技有限公司；抗体JMJD3（批号：3457S）购自美国Cell Signaling Technology 公司；抗体MD-2（批号：ab24182）购自英国Abcam 公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（批号：L8880）、HE 染色试剂盒（批号：G1120）、高效RIPA 蛋白裂解液（批号：R0010）、BCA 蛋白浓度检测试剂盒（批号：PC0020）、ECL 化学发光法检测试剂盒（批号：SW2010）均购自北京索莱宝科技有限公司；Sco 粉剂（批号：HY-N0228）购自美国MedChemExpress 公司；RPMI 1640 培养基（批 号：11875093）、FBS（批号：30044333）均购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；JMJD3 质粒由吉玛基因（苏州）合成；原位末端转移酶标记法（TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）试剂盒（批号：12156792910）购自美国Roche公司；化学发光成像系统（型号：ChemiScope 6200）购自上海勤翔科学仪器有限公司；酶标仪（型号：1681130 iMarkiMark）购自美国BIO-RAD 公司；荧光显微镜（型号：dm6000）购自美国Leica 公司；流式细胞仪（型号：CytoFLEX CytoFLEX）购自贝克曼库尔特国际贸易（上海）有限公司。

1.3 动物分组和模型构建 采用随机数字表法将小鼠分为对照组、LPS 组、LPS+40 mg/kg Sco 组和LPS+80 mg/kg Sco 组，每组6 只。除对照组外，其余3 组小鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg（100 mg LPS 溶于20 mL 的0.9%氯化钠注射液）建立脓毒症相关AKI 模型。造模成功后，LPS+40 mg/kg Sco 组和LPS+80 mg/kg Sco 组分别腹腔注射Sco 40 mg/kg（50 mg Sco 粉剂溶于1 mL DMSO，0.8 mL/kg）和80 mg/kg（50 mg Sco 粉剂溶于1 mL DMSO，1.6 mL/kg），连续3 d。对照组小鼠腹腔注射0.9%氯化钠注射液2 mL/kg。3 d 后，将所有小鼠麻醉，收集血液样本并进行安乐死，采集小鼠肾脏组织，待下一步检测。

1.4 细胞分组和模型构建 HK-2 细胞置于含10%FBS、100 U/mL 链霉素和100 U/mL 青霉素的RPMI 1640 培养基中，37 ℃，5%CO2的条件下进行培养。细胞实验包 括 两个部分：（1）分为Control 组、LPS 组、LPS+30 μmol/L Sco 组和LPS+60 μmol/L Sco 组，LPS 组使用1 μg/mL LPS 处理HK-2 细胞24 h；对照组不用LPS 处 理；LPS+30 μmol/L Sco 组 在LPS 诱导HK-2 细胞前，给予30 μmol/L Sco 干预24 h；LPS+60 μmol/L Sco 组在LPS 诱导HK-2 细胞前，给予60 μmol/L Sco 干预24 h。（2）分为LPS 组、LPS+60 μmol/L Sco 组、LPS+60 μmol/L Sco+过表达对照（oe-NC）组和LPS+60 μmol/L Sco+过表达JMJD3（oe-JMJD3）组，LPS 组使用1 mg/L LPS 处理HK-2 细胞24 h；LPS+60 μmol/L Sco 组在LPS诱导HK-2 细胞前，给予60 μmol/L Sco 干预24 h；LPS+60 μmol/L Sco+oe-JMJD3 组在Sco 干预后在细胞中转染JMJD3 质粒；LPS+60 μmol/L Sco+oe-NC 组在Sco 干预后在细胞中转染空白质粒载体。HK-2 细胞按3×105个/mL 接种于6 孔板中，在细胞融合度达到60%～80%时，更换为含JMJD3 质粒的腺相关病毒的无血清培养基，24 h 后更换为完全培养基。

1.5 小鼠观测指标

1.5.1 小鼠肾脏组织形态观察 采用HE 染色。小鼠安乐死后，将各组小鼠肾脏用4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，5 μm 厚切片，二甲苯脱蜡，与苏木精室温下孵育5 min，洗涤后使用伊红在室温下孵育约2 min。显微镜下观察肾脏组织的病理变化并拍照。

1.5.2 小鼠肾脏组织细胞凋亡水平检测 采用TUNEL 染色。取各组小鼠肾脏组织石蜡切片，将50 μL TDT 酶混合物（TDT 酶∶荧光标记液=1∶9）滴加至切片表面，37 ℃孵育1 h，PBS 洗3 次，5 min/次，荧光显微镜下观察并拍照。

1.5.3 小鼠肾功能指标Scr、BUN 水平检测 采用ELISA 法。严格按照ELISA 试剂盒操作说明书检测小鼠血清中Scr 和BUN 水平。

1.5.4 小鼠肾脏组织JMJD3 和MD-2 蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。使用蛋白质裂解缓冲液提取小鼠肾脏组织总蛋白，离心后收集上清液。用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白质浓度。制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶并用于电泳。将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，并在室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h。随后加入一抗（抗JMJD3、抗MD-2），4 ℃下孵育12 h。加入二抗并在室温下孵育1.5 h。采用ECL化学发光法检测试剂盒进行化学发光检测。使用Image J 软件计算各组灰度值，蛋白相对表达水平=各组灰度值/第1 泳道对照组平均灰度值。

1.6 细胞观测指标

1.6.1 细胞凋亡水平检测 采用流式细胞术。收集细胞并调整浓度为1×106个/mL，4 ℃下70%冰冷乙醇固定过夜。用PBS 洗涤后，将细胞与Annexin Ⅴ和碘化丙啶染色溶液混合，在室温下孵育30 min，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.6.2 细胞JMJD3 和MD-2 蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。在细胞中添加蛋白质裂解缓冲液，离心后收集上清液。用BCA 蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白质浓度。制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶并用于电泳。将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，并在室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h。随后加入一抗（抗JMJD3、抗MD-2），4 ℃下孵育12 h。加入二抗并在室温下孵育1.5 h。采用ECL 化学发光法检测试剂盒进行化学发光检测。使用Image J 软件计算各组灰度值，蛋白相对表达水平=各组灰度值/第1 泳道对照组平均灰度值。

1.7 统计学处理 采用SPSS 22.0 和GraphPad Prism 6.0 统计软件。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。所有实验重复3 次。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠观测指标

2.1.1 Sco 对小鼠肾脏组织损伤的影响 HE 染色结果显示，对照组小鼠肾脏组织未发现明显病理变化；与对照组相比，LPS 组小鼠肾脏组织有明显的病理变化，部分肾小管变形，细胞核消失，肾间质周围炎症细胞浸润，而Sco 能明显缓解AKI 小鼠肾脏组织以上病理变化，见图1A（插页）。另外，TUNEL 染色结果显示，LPS组小鼠肾脏组织细胞凋亡信号（棕褐色）明显增强，而Sco 能逆转这种情况，棕褐色明显减弱，且LPS+80 mg/kg Sco 组逆转效果更加明显，见图1B（插页）。

图1 Sco 对小鼠肾脏组织损伤的影响（A：4 组小鼠肾脏组织损伤的病理检查所见，HE 染色，×400；B：4 组小鼠肾脏组织细胞凋亡图，TUNEL 染色，×400）

2.1.2 4 组小鼠血清中Scr 和BUN 水平比 较 4 组小鼠血清中Scr 和BUN 水平比较差异均有统计学意义（F=7.189 和1.552，P=0.009 和0.001）。与对照组相比，LPS 组小鼠血清中Scr和BUN水平均升高（均P＜0.01）。与LPS组相比，LPS+40 mg/kg Sco 组和LPS+80 mg/kg Sco组小鼠血清中Scr 和BUN 水平均下降（均P＜0.05），且LPS+80 mg/kg Sco 组小鼠下降更明显，见图2。

图2 4 组小鼠血清中Scr 和BUN 水平比较（A：4 组小鼠血清中Scr 水平比较；B：4 组小鼠血清中BUN 水平比较）

2.1.3 4 组小鼠肾脏组织中JMJD3 和MD-2 蛋白表达水平比较 4 组小鼠JMJD3 和MD-2 蛋白表达水平比较差异均有统计学意义（F=2.203 和2.359，P=0.014 和0.046）。与对照组相比，LPS 组小鼠肾脏组织中JMJD3和MD-2 蛋白表达水平均上升（均P＜0.01）。与LPS 组相比，LPS+40 mg/kg Sco 组和LPS+80 mg/kg Sco 组小鼠肾脏组织中JMJD3 和MD-2 蛋白表达水平均下降（均P＜0.05），且LPS+80 mg/kg Sco组下降更明显，见图3。

图3 4 组小鼠肾脏组织中JMJD3 和MD-2 蛋白表达水平比较（A：4 组小鼠肾脏组织JMJD3 和MD-2 蛋白表达的电泳图；B：4 组小鼠肾脏组织JMJD3 和MD-2 蛋白表达的柱状图）

2.2 细胞观测指标

2.2.1 4 组细胞凋亡水平比较 4 组细胞凋亡水平比较差异有统计学意义（F=2.351，P=0.039）。与对照组相比，LPS 组细胞凋亡水平上升（P＜0.05）。与LPS 组相比，LPS+30 μmol/L Sco 组和LPS+60 μmol/L Sco 组细胞凋亡水平均下降（均P＜0.05），且LPS+60 μmol/L Sco组干预效果更加明显，见图4（插页）。

图4 4 组细胞凋亡水平比较

2.2.2 4 组细胞JMJD3、MD-2 蛋白表达水平比较 4组细胞JMJD3 和MD-2 蛋白表达水平比较差异均有统计学意义（F=3.348 和2.971，P=0.003 和0.048）。与对照组相比，LPS 组细胞JMJD3 和MD-2 蛋白表达水平上升（均P＜0.01）。与LPS 组比较，LPS+30 μmol/L Sco组和LPS+60 μmol/L Sco 组细胞JMJD3 和MD-2 蛋白表达水平下降均下降（均P＜0.05），见图5。

图5 4 组细胞JMJD3、MD-2 蛋白表达水平比较（A：4 组细胞JMJD3 和MD-2 蛋白表达的电泳图；B：4 组细胞JMJD3 和MD-2 蛋白表达的柱状图）

2.2.3 oe-JMJD3 后4 组细胞凋亡水平比较 oe-JMJD3后4组细胞凋亡水平比较差异有统计学意义（F=4.332，P=0.013）。与LPS 组相比，LPS+60 μmol/L Sco 组细胞凋亡水平下降（P＜0.01）。与LPS+60 μmol/L Sco+oe-NC 组相比，LPS+60 μmol/L Sco+oe-JMJD3 组细胞凋亡水平上升（P＜0.05），见图6（插页）。

图6 oe-JMJD3 后4 组细胞凋亡水平比较

2.2.4 oe-JMJD3 后4 组细胞JMJD3、MD-2 蛋白表达水平比较 oe-JMJD3 后4 组细胞JMJD3 和MD-2 蛋白表达水平比较差异均有统计学意义（F=1.387 和1.110，P=0.008 和0.017）。与LPS 组 相 比，LPS+60 μmol/L Sco 组细胞JMJD3 和MD-2 蛋白表达水平均下降（均P＜0.01）。与LPS+60 μmol/L Sco+oe-NC 组相 比，LPS+60 μmol/L Sco+oe-JMJD3 组细胞JMJD3 和MD-2蛋白表达水平均上升（均P＜0.05），见图7。

图7 oe-JMJD3 后4 组细胞JMJD3、MD-2 蛋白表达水平比较（A：oe-JMJD3 后4 组细胞JMJD3 和MD-2D 蛋白表达的电泳图；B：oe-JMJD3 后4 组细胞JMJD3 和MD-2 蛋白表达的柱状图）

3 讨论

血清Scr 和BUN 是肾功能评估中使用最广泛的生物标志物。在脓毒症相关AKI 中，机体最明显的变化之一就是血清Scr 和BUN 水平升高[5]。本研究通过LPS 建立了脓毒症相关AKI 小鼠模型，小鼠血清Scr和BUN 水平明显升高，Sco 干预能逆转这种现象，提示Sco 能提高肾功能。此外，小鼠肾脏组织HE 和TUNEL 染色发现，与对照组相比，LPS 组小鼠肾脏组织出现明显的组织损伤和细胞凋亡，而Sco 干预能明显改善肾脏组织损伤并抑制细胞凋亡。

肾小管上皮细胞凋亡是AKI 最常见的病理特征之一。本研究选择对HK-2 细胞进行培养，通过LPS 建立体外AKI 模型，LPS 显著促进了细胞凋亡。对LPS诱导的HK-2 细胞模型给予Sco 干预后，细胞凋亡受到抑制。Sco 能促进脓毒症相关AKI 中肾小管上皮细胞的损伤修复。在既往研究中，Sco 能显著抑制氧糖剥夺再复氧诱导的海马神经元细胞凋亡[6]，促进真皮细胞的增殖，抑制其凋亡[7]。Sco 显著提高了缺血再灌注中心肌细胞活力和抗凋亡蛋白的表达，降低了心肌细胞凋亡率和促凋亡蛋白的表达[8-10]。可见Sco 能促进细胞的损伤修复，但是Sco 对HK-2 细胞的具体作用机制还未阐明。

研究表明JMJD3 有助于中性粒细胞mPR1 高表达，从而促进早期脓毒症中促炎IL-1β 的产生[11]。已知JMJD3 参与细胞分化、增殖、衰老和凋亡的生物过程，因此JMJD3 与机体发育和疾病进展有关[12]。如JMJD3（-/-）神经元表现出细胞凋亡抑制和对氧糖剥夺损伤的耐受性[13]。本研究发现在LPS 诱导的AKI 小鼠模型以及HK-2 细胞模型中，JMJD3 表达上调，给予Sco 干预以后，JMJD3 表达被抑制。进一步oe-JMJD3后，细胞凋亡水平上升。因此在脓毒症相关AKI 中，Sco 能通过抑制JMJD3 的表达缓解疾病的发展。MD-2在脓毒症小鼠模型中上调，MD-2 能激活核苷酸结合寡聚结构域，从而加剧脓毒症小鼠的神经炎症和认知障碍[14]。在LPS 诱导的AKI 模型中，MD-2 也显著影响了炎症反应[15]。MD-2 是Toll 样受体4 识别LPS 所必需的，同样参与细胞凋亡的过程[16-17]。本研究通过在HK-2 细胞中转染oe-JMJD3 质粒，发现oe-JMJD3 能促进MD-2 表达。

综上所述，本研究发现Sco 能缓解脓毒症相关AKI小鼠肾脏组织的损伤，抑制LPS 诱导的HK-2 细胞凋亡并且这种作用是通过调节JMJD3 和MD-2 的表达实现的。本研究为脓毒症相关AKI 的治疗提供了新的思路和科学的理论基础。