4种固定液对乳腺癌冰冻切片固定效果对比

黄斐一 福建省厦门市妇幼保健院病理科 361003

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,是女性癌症死亡的主要原因。2020年全球最新癌症负担数据显示,乳腺癌已成为全球发病率最高的癌症[1]。乳腺癌的治疗方式以手术切除为主,术中常常通过快速冰冻病理诊断来确定肿物的性质,决定手术方式和手术范围。若患者前哨淋巴结转移,还需进行淋巴结清扫术,故术中肿物和前哨淋巴结的冰冻病理诊断非常重要。由于组织的特异性和时间的限制,冰冻切片质量往往不如石蜡切片。冰冻切片的质量会影响诊断的速度和准确性,为了提高冰冻切片质量,笔者通过对比4种固定液及3个不同固定时间来找出适合乳腺癌手术的固定液及固定时间。

1 材料和方法

1.1 标本来源 收集本院病理科2023年3月新鲜乳腺癌肿物、前哨淋巴结标本各15例。

1.2 仪器及试剂 Thermo CryoStar NX50冰冻切片机,Gemini AS Heated全自动染色机,包埋剂OCT,Thermo MX35型一次性刀片;苏木精染液、1%盐酸乙醇分化液、0.5%氨水返蓝液、1%醇溶性伊红(购自中山市奥博生物科技有限公司),各浓度梯度乙醇,二甲苯,中性树胶。固定液: 冷丙酮: 置于 4℃ 冰箱保存备用;95%乙醇;10%中性福尔马林;AAF 液:95%乙醇 85mL、40%甲醛 10mL、冰醋酸5mL。

1.3 方法 将Thermo CryoStar NX50冰冻切片机设置为-10℃,肿物、前哨淋巴结置于OCT包埋剂包埋,速冻后肿物连续切片12张,每张4.5μm,淋巴结连续切片12张,每张3μm,肿物12张切片平均放入4种固定液,这样每种固定液有3张切片,3张切片分别固定1min、4min、7min,淋巴结同上。固定后放入快速冰冻染色机,染色机设定为苏木素染色3min,水洗10s,盐酸乙醇分化5s,水洗10s,0.5%氨水返蓝5s,水洗10s,醇溶性伊红40s,95%乙醇10s,无水乙醇10s后取出,电风吹吹干,中性树胶封片。

1.4 HE染色情况观察 每张切片按照细胞形态(0～10分),细胞清晰度(0～10分),核质对比度(0～10分)打分,3个指标之和为该片分值,即满分为30分。15例的平均值为该种固定液在该固定时间下的分值。

1.5 统计学方法 采用 SPSS22.0 进行统计学分析,组间和组内比较用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿物在不同固定液和不同固定时间下HE染色情况 肿物在固定1min时,AAF固定液与95%乙醇固定效果无明显差异(P=0.997>0.05),但明显优于冷丙酮和10%中性甲醛(P<0.05)。固定4min和7min时,4组固定液均有显著性差异(P<0.05),AAF固定液固定效果最佳,其次依次为95%乙醇、冷丙酮、10%中性甲醛。95%乙醇、10%中性甲醛随时间延长,染色效果无明显差异(P>0.05),而AAF液、冷丙酮固定4min与7min无明显差异(P>0.05),但均比固定1min效果好,见表1。肿物切片在固定4min时,AAF液固定的切片细胞形态较正常,细胞清晰,核质对比良好(见图1),95%酒精固定的细胞尚清晰,细胞收缩,核质对比度一般(见图2),冷丙酮固定的切片细胞染色较差,细胞明显收缩,核质对比度不良(见图3),10%中性福尔马林固定的细胞固缩,染色模糊,核质对比度差,无法诊断(见图4)。

图1 肿物在95%酒精固定4minHE染色

图3 肿物在冷丙酮固定4min的HE染色

表1 肿物在不同固定液和不同固定时间下HE染色评分

2.2 淋巴结在不同固定液和不同固定时间下HE染色情况 淋巴结在固定1min和4min时,AAF固定液与95%乙醇固定效果无明显差异(P>0.05),10%中性甲醛固定效果最差。固定7min时,4组固定液均有显著差异(P<0.05),AAF液固定效果最好,其次依次为95%乙醇、冷丙酮、10%中性甲醛。AAF液固定1min、4min、7min均有显著性差异(P<0.05),而其他固定液固定效果无显著改变(P>0.05),见表2。淋巴结在AAF液与95%乙醇中固定4min(见图5～6),细胞和组织结构尚清晰,无明显差异,在冷丙酮10%中性甲醛中固定4min细胞结构不清,细胞收缩,染色不鲜艳,核质对比不清(见图7),在10%中性甲醛中固定4min细胞结构模糊,核固缩,无法观察(见图8)。

图5 淋巴结在AAF液固定4min的HE染色

图7 淋巴结在冷丙酮固定4min的HE染色

表2 淋巴结在不同固定液和不同固定时间下HE染色评分

3 讨论

乳腺癌患者术中冰冻肿物的性质、浸润与否、淋巴结有无癌转移均决定患者不同的手术方式,故术中冰冻诊断结果极其重要。在冰冻制片过程中,固定是极其重要的步骤,一张优质的切片是建立在适当而完全的固定基础上的,固定不良,将导致后续的染色不良,影响诊断。本次实验由3名医生对切片进行评分,染色的苏木素、醇溶性伊红均采购已验证稳定的试剂,每种固定液均实验当天配置,保证结果的可靠性。

10%中性福尔马林是 HE 染色中最常用的固定液之一,但其在冷冻切片中表现欠佳,可能与10%中性福尔马林成分中含水量较多、无法低温固定,造成了组织自溶,不适应于对冷冻切片组织进行快速固定的样本[2],且用10%中性福尔马林缓冲液固定冷冻切片时间长,需固定10min以上[3],故短时间固定效果差,组织形态模糊,核固缩,核质对比度差,无法诊断。丙酮为极易挥发、易燃的无色液体,可使蛋白质沉淀,渗透力强,核的固定不好,易使组织收缩[4]。冷丙酮固定的冰冻切片组织结构可见,但细胞核模糊,皱缩明显,对比度欠佳,着色不均匀。冷丙酮冰冻固定一般在10min以上,故短时间固定效果不良,肿物切片延长固定时间,染色效果有改善,而淋巴结细胞较多,间质较少的组织,延长固定时间,染色效果没有显著变化。95%乙醇用于固定,对纤维蛋白和弹性纤维等固定效果好,其渗透力弱,能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白,但核蛋白经沉淀后,能溶于水,不利于染色体的固定[5]。高浓度乙醇对组织有较大收缩力,而AAF液在95%乙醇的基础上加入了甲醛和醋酸,甲醛对组织染色效果较好,醋酸可以防止乙醇引起的收缩,醋酸能沉淀核蛋白,因此染色质固定很快,对蛋白质具有保存作用。本实验固定1min时两者差距显微镜下观察并不明显,可能是由于本实验经过95%乙醇固定后的切片不水洗,直接苏木素染色,避免洗涤造成核蛋白流失,影响染色,也可能与AAF液中酒精对组织的收缩作用尚不能防止冷冻引起的细胞内液体膨胀和冰醋酸对组织的膨胀作用,仍可引起核溶解,导致胞核染色欠佳有关[6]。当固定4min,两者出现差距,肿物在AAF液固定效果明显更好,AAF 液中的乙醇起快速固定作用,甲醛固定速度慢,起补充固定作用,而冰醋酸既可抵抗甲醛和乙醇对组织细胞的皱缩又有助染作用[7]。而淋巴结组织细胞密集,AAF液固定7min效果明显优于其他几种固定液。有文献显示用AAF液固定6min、8min、10min免疫组化染色较清晰、均匀,细胞形态良好,阳性信号定位清楚,定量准确,背景较浅,而固定1min免疫染色普遍较弱,细胞形态较差,阳性信号定位与定量均不理想,并可出现假阳性或假阴性[8]。

综上所述,AAF液固定乳腺癌冰冻切片效果最好,肿物切片固定4min,淋巴结切片固定7minHE染色效果优于其他时间。