蛋白核小球藻原位催化制备生物柴油的研究

＊刘欢 王一同 郭璇

（华北理工大学 河北 063210）

在工业化时代，不可再生化石燃料的枯竭和温室气体过度排放促使人们开始发掘第三代原料（微藻）生产生物柴油的潜力，微藻生物柴油因其碳中性、环境友好和可持续性备受关注[1-2]。蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）具有以下优势：（1）生长条件简单、生长速度快、光合效率高。（2）拥有高效固定二氧化碳和处理废水的能力。（3）高生物量，富含高价值化合物（如脂质和碳水化合物）[3]。

传统上，微藻生物质合成生物柴油包括两个步骤，一是从微藻生物质中提取油；二是将微藻油催化酯交换为生物柴油。传统的两步法需要消耗更多能量，不具有良好的经济价值，而“一步”原位酯交换法可以解决这个问题。原位酯交换法是指使用含油原料提取油并催化转化为生物柴油的一步过程，即提油和催化酯交换同时进行[4-5]。原位酯交换过程中催化剂的加入大大加快了反应速率，用于生产生物柴油的优选催化剂是均相催化剂，因为它们使用简单并且完成反应所需时间短。均相催化剂中最常用的就是H2SO4，因为它的价格低，可以在低温和低压下进行，与其他无机酸（H3PO4、HCl 和有机磺酸）相比，H2SO4的特征在于较高水平的活性[6]。H2SO4催化的酯交换反应需要大量的醇（如甲醇）以获得高产率的生物柴油。在原位酯交换法中，甲醇具有双重功能，分别作为脂质提取的化学溶剂和反应物，从而减少化学溶剂的投入，该技术消除了昂贵繁琐的细胞破坏和干燥步骤，最大限度地减少了脂质提取和溶剂回收步骤，大大降低了该过程的能耗，减少了初始投资和间接成本[7-8]。Juliana S.Lemões 等人[9]分别使用原位酯交换法和萃取-酯交换法（先萃取后酯交换）生产脂肪酸乙酯。结果表明，原位酯交换法产生的生物柴油质量更高，且原位酯交换是一种更有效、更环保、更绿色的方法。生物柴油的质量与不含双键的饱和脂肪酸占比密切相关。生产生物柴油的首选脂肪酸是具有中等长度碳链的C16 家族（如棕榈酸）和C18 家族（包括油酸、亚油酸和硬脂酸），这些脂肪酸能抵抗生物柴油的降解和自氧化，从而产生更多的十六烷，这是决定生物柴油燃烧质量和喷射到点火延迟时间的关键设置。高百分比的饱和脂肪酸是获得高质量生物柴油的理想选择[10-11]。

本研究使用的是培养收获冷冻干燥后的干蛋白核小球藻藻粉，通过原位酯交换催化微藻细胞中的脂质转化为高附加值的生物柴油；通过对微藻生物柴油产率和组分分析，探讨蛋白核小球藻原位酯交换生产生物柴油的能力。

1.试验部分

(1)试验试剂

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），BG11 培养基，上海光语生物科技有限公司；甲醇（CH3OH，≥99.5%）、硫酸（H2SO4，95.0%～98.0%）、石油醚（AR）、十七酸甲酯（C17:0，≥99%）、棕榈酸甲酯（C16:0，≥99.0%）、油酸甲酯（C18:1，≥99.0%）、硬脂酸甲酯（C18:0，≥99.5%）、棕榈油酸甲酯（C16:1，＞99%），上海阿拉丁生化技术有限公司；亚麻酸甲酯（C18:3，＞99.5%）、亚油酸甲酯（C18:2，＞99%），上海麦克林生化科技有限公司；十七烯酸甲酯（C17:1，＞99%），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；二氯甲烷（CH2Cl2），天津津东天正精细化学试剂厂。

(2)试验仪器

艾柯超纯水机（Exceed-Ad-32），成都艾柯水处理设备有限公司；电子分析天平（FA-2004）、循环水真空泵（SHZ-D）、超净工作台（SW-CJ-1D）、油浴锅（DF-101S）、高温蒸汽灭菌锅（DGL-50B），上海力辰邦西仪器科技有限公司；pH 计（PHS-3E），上海仪电科学仪器股份有限公司；光照培养箱（GXZ-500B），宁波江南仪器厂；高速离心机（H3-18K），湖南可成仪器设备有限公司；冷冻干燥机（SCIENTZ-10N），宁波新芝生物科技股份有限公司；气相色谱仪（GC-2014C），岛津（上海）实验器材有限公司。

(3)蛋白核小球藻培养

用电子分析天平称取一定质量的BG11 固体培养基溶解于蒸馏水中，配置BG11 培养基，在高温蒸汽灭菌锅中于121 ℃下灭菌20 min，随后冷却至25 ℃，用0.45μm 有机过滤膜抽滤掉杂质后备用。将经过多次扩培后高活性的蛋白核小球藻（50 mL）接种于BG11 培养基中，接种操作在超净工作台中完成。将接种后的培养基（1000 mL）转移到光照培养箱中，培养条件设置为：培养温度25 ℃，光照强度4000 Lux 和昼夜比12/12。培养结束后，将藻液用高速离心机（8000 r/min，10 min）离心，移除上清液，沉淀物转移至冷冻干燥机在-50 ℃下干燥蛋白核小球藻得到藻粉。

(4)微藻原位催化制备生物柴油

称取蛋白核小球藻粉末（1 g）、甲醇（19 mL）、H2SO4（1 mL），三者放入50 mL 玻璃瓶中，将油浴锅温度设置为90 ℃，磁力搅拌2 h。反应结束后，产物分为两相，上相为混合液产物（粗生物柴油），下相为藻渣。取上相粗生物柴油，用去离子水洗涤去除H2SO4，直至洗到pH 值为7.00。将石油醚（10 mL）加入洗涤后的粗生物柴油中，形成混合液产物，离心后分为两相，上相为生物柴油和石油醚的混合物，下相为甘油。取上相，用0.22μm 有机过滤膜过滤混合的生物柴油和石油醚，将加热板温度设置为75 ℃，加热至恒重，用气相色谱仪定性定量分析。

在酸催化的甲酯化制生物柴油的过程中，同时发生着游离脂肪酸的酯化反应和甘油酯与甲醇之间的酯交换反应。酯交换反应过程比较复杂，油脂中的3 个脂肪酸依次与甲醇反应，生成脂肪酸甲酯（FAME），甘油三酯依次变为甘油二酯和甘油酯，最后转化为甘油[12]。反应总方程式如图1。

图1 酯交换反应过程原理图

使用气相色谱仪，将参数设置为进样温度250 ℃，色谱柱初温140 ℃，保持5 min 恒定后，以2 ℃/min 升温至230 ℃，保持20 min，检测器温度260 ℃，载气流速1 mL/min，分流比为10:1，分析预处理后的微藻生物柴油（脂肪酸甲酯，FAME）。以二氯甲烷作为溶剂，十七烷酸甲酯（HAME，C17:0）为内标物，对生物柴油样品进行定量分析，根据标准甲基物的权重、标定因子和峰面积，计算生物柴油产率。

式中：

Y—生物柴油产率，%；

WHAME—HAME 的质量，g；

AFAME—FAME 的色谱峰峰面积，uV·min；

AHAME—HAME 的色谱峰峰面积，uV·min；

Fi—校正因子；

WC—粗生物柴油的质量，g。

棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯和十七烯酸甲酯对十七酸甲酯的校正因子分别为1.563、0.977、0.952、1.025、0.564、1.345 和1.027。每种脂肪酸甲酯按气相色谱外标法测定。

2.结果与讨论

蛋白核小球藻原位催化生物柴油。干燥后的蛋白核小球藻在90 ℃下用H2SO4催化2 h 进行原位酯交换，获得了76.86%的高生物柴油产率，通过气相色谱分析结果，主要发现了7 种不同的脂肪酸。表1 给出了生物柴油中脂肪酸的组成和浓度，主要脂肪酸甲酯为C16:0、C16:1、C17:1、C18.0、C18:1、C18:2 和C18:3，其中，C18:2 的含量比例超过38.12%。C16 家族脂肪酸甲酯含量占比超过22.05%，C18 家族脂肪酸甲酯含量占比超过66.59%。高浓度的C16 和C18 家族脂肪酸甲酯是生物柴油的理想原料，高饱和脂肪酸含量被认为有利于生物柴油的冷流动性能和氧化稳定性[13-14]，这表明蛋白核小球藻原位酯交换生产出了高质量的生物柴油。

表1 蛋白核小球藻原位酯交换生产的生物柴油（脂肪酸甲酯）组分占比

3.结论

原位酯交换法被认为是从微藻商业化生产生物柴油的重大改进。在传统的两步酯交换工艺中，脂质提取和酯交换分为两步来生产生物柴油，由于传统酯交换工艺的繁琐复杂，近些年“一步”原位酯交换更受到研究者的喜爱。生物柴油的质量取决于存在的长链脂肪酸的性质，C16 和C18 脂肪酸的存在表明了高质量生物柴油的可能性。本研究利用培养的蛋白核小球藻直接进行原位酯交换生产生物柴油，对其生物柴油产率及其组分占比进行分析。结果表明，培养蛋白核小球藻原位酯交换生物柴油产率高达76.86%，过程中还产生了C16（22.05%）和C18（66.59%）的高价值生物柴油组分。