高氧诱导大鼠肺泡Ⅱ型细胞内质网自噬与其功能的关系

刘嘉璐,于恺华,郭 鸿,姚 莹,鲍振星,施华清,李玉兰,3*

(1.兰州大学第一临床医学院,甘肃 兰州730000;2.兰州大学第二临床医学院,甘肃 兰州730000;3.兰州大学第一医院 麻醉科,甘肃 兰州730000)

全身麻醉或ICU(Intensive care unit)患者高氧血症发生率高达83%[1],高氧可能对机体产生毒性作用[2]。肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial type Ⅱ cell,AECⅡ)是高氧介导肺损伤的关键细胞[3],AECⅡ分泌的二棕榈酰卵磷脂(DPPC),是肺表面活性物质的主要成分,对维持肺泡形态稳定具有重要作用[4]。内质网是细胞内蛋白合成、分泌的场所,也是维持细胞内环境稳态、提高细胞适应性的物质基础[5]。内质网自噬(endoplasmic reticulum autophagy,ER-phagy)是细胞自噬的一种类型,在维持内质网稳态、缓解内质网应激、防御细菌和病毒感染的过程中发挥重要作用[6]。有研究表明细胞自噬参与了慢性阻塞性肺疾病(COPD)、特发性肺纤维化、急性肺损伤等肺部疾病的调节[7]。肺细胞的自噬不足或过度均可引起或加重肺损伤[8-10]。高氧肺损伤过程是否诱发了AECⅡ内质网自噬,内质网自噬对AECⅡ产生表面活性物质的功能有无影响,目前尚不明确。本实验建立AECⅡ高氧模型,研究不同时长高氧条件下AECⅡ内质网自噬及其DPPC产生的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 RLE-6TN购自北京北纳创联生物技术研究院,为永生化大鼠 AECⅡ。

1.1.2主要试剂 RPMI-1640培养基、胎牛血清、链霉素、青霉素、0.25%胰酶、引物均购自武汉塞维尔生物科技有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、实时荧光定量PCR(TB Green○RPremix Ex TaqTMII)购自Takara Bio宝日医生物技术(北京)有限公司;DPPC酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自上海源桔生物科技公司;ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62抗体及GAPDH抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.1.3细胞培养及分组 RLE-6TN细胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基,置于37℃、5% CO2的常规培养箱中培养,待细胞覆盖培养瓶80%～90%时,用胰酶消化并传代,2～3 d传代1次,取对数生长期细胞接种于培养瓶中,培养48 h不分段后采用随机数字表法将细胞分为对照组(C组,21% O2常规培养72 h) 、高氧12、24、48、72 h组(H1、H2、H3、H4组,95% O2分别培养12、24、48、72 h)。

1.2 方法

1.2.1qRT-PCR检测mRNA表达 收集各组细胞,采用Trizol 法提取总RNA,紫外分光光度计进行定量检测。PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录,实时荧光定量PCR(TB Green○R Premix Ex TaqTMII)试剂盒进行qRT-PCR测定。以GAPDH作为内参,扩增基因为FAM134B、SEC62、ATL3、RTN3、CCPG1。反 应 程 序:95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s 和 60 ℃ 30 s,40 个循环s。采用 2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。qRT-PCR引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.2.2Western blotting检测CCPG1、FAM134B蛋白相对表达 利用 BSA蛋白定量试剂盒进行定量,不同样品取等量的蛋白质(20 μg);6% SDS-Page变性胶电泳,条件为80 V,30 min后,将电压调至120 V,继续电泳90 min;恒流250 mA转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭1 h后,孵育使用相关一抗,4℃振摇过夜;次日5% PBST洗膜,10 min,4次;孵育对应的二抗,振摇1 h,5% PBST洗膜,10 min,3次;暗房曝光显影,采用Image J软件对条带进行统计分析。

1.2.3ELISA法检测DPPC水平 将细胞用RIPA裂解离心后取上清液,加入准备好的样品和标准品,37℃温育30 min;洗板5次,加入酶标试剂,37℃温育30 min;洗板5次,加入显色液A、B,37℃温育30 min;加入终止液;15 min之内读取OD值。测定DPPC浓度。

1.3 统计学分析

采用 GraphPad Prism 9.5.0软件进行分析,符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,多组间采取单因素方差分析(one-way ANOVA)进行比较。P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR检测ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA表达

如图1所示:与C组相比,H1组ATL3、SEC62的mRNA水平下降(P均<0.05),CCPG1、FAM134B、RTN3的mRNA水平显著下降(P均<0.01);H2组ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA水平差异无统计学意义(P均>0.05);H3、H4组ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA水平显著下降(P均<0.01)。与H1组相比,H2组CCPG1、FAM134B的mRNA水平显著升高(P均<0.01);H3组RTN3的mRNA水平下降(P<0.05);H4组ATL3的mRNA水平下降(P<0.05),RTN3的mRNA水平显著下降(P<0.01)。与H2组相比,H3组、H4组ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3的mRNA水平显著下降(P均<0.01);H4组SEC62的mRNA水平下降(P<0.05);其余各组均无统计学差异(P均>0.05)。

图1 高氧处理的各组细胞ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA表达

2.2 Western blotting检测相关蛋白的表达情况

如图2所示:与C组相比,H1组CCPG1的蛋白水平下降(P<0.05),ATL3、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平显著下降(P<0.01);H2组ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平差异无统计学意义(P均>0.05);H3组和H4组ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平显著下降(P均<0.01)。与H1组相比,H2组ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平显著增高(P<0.01);H3组ATL3、SEC62的蛋白水平显著下降(P<0.01),RTN3的蛋白水平下降(P<0.05);H4组ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平显著下降(P<0.01),CCPG1的蛋白水平下降(P<0.05),其余各组的蛋白水平差异无统计学意义(P均>0.05)。与H2组相比,H3组ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平显著下降(P<0.01),CCPG1、FAM134B的蛋白水平下降(P<0.05);H4组ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平显著下降(P<0.01)。与H3组相比,H4组ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平显著下降(P<0.01)。其余各组的蛋白水平差异无统计学意义(P均>0.05)。

图2 高氧处理的各组细胞Western blotting检测ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62蛋白表达

2.3 ELISA法检测DPPC含量

如图3所示:与C组相比,H1组DPPC产量下降(P<0.05);H2组DPPC产量增高(P<0.05);H3、H4组DPPC产量下降(P均<0.01)。与H1组相比,H2组DPPC产量显著增高(P<0.01);H3组、H4组DPPC产量差异无统计学意义(P均>0.05)。与H2组相比,H3组、H4组DPPC产量显著下降(P<0.01),其余各组比较差异无统计学意义。

图3 高氧处理的各组细胞DPPC产量

3 讨论

本研究基于大多数ICU重症患者吸氧治疗时间[11],探究不同时间高氧暴露对AECⅡ内质网自噬与肺泡表面活性物质产生功能之间的关系。结果显示,高氧12 h后,内质网自噬受体水平下降,自噬蛋白ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62表达下降,DPPC产量也随之下降;高氧24 h后,内质网自噬受体mRNA恢复到基础水平,ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62蛋白表达也得到恢复,此时DPPC产量达到峰值;高氧48 h后,内质网自噬受体mRNA水平、ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62蛋白表达、DPPC产量再次下降;高氧72 h后,内质网自噬受体mRNA水平、ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62蛋白表达、DPPC产量仍保持较低水平。这些数据表明高氧12 h可抑制内质网自噬水平,并影响DPPC产生;高氧24 h后,随着内质网自噬水平的恢复,DPPC产量升高并且达到了峰值;高氧48～72 h后,内质网自噬水平和DPPC产量再一次下降并维持在较低水平。因此,AECII内质网自噬与肺泡表面活性物质产生功能之间有密切的关系。

氧疗是治疗肺部疾病最常用的方法,短期内可能有益,但长期来看并非没有风险,它会导致高氧肺损伤(HALI)[12],HALI的机制非常复杂,至今尚未完全清楚,其特征是严重的免疫细胞浸润和AECⅡ的死亡。AECⅡ具有合成分泌表面活性物质、肺水转运和免疫防御的功能,与肺损伤及其修复有着密切的关系[13]。肺泡表面活性物质是磷脂(PL)和蛋白质(SP)的混合物,可降低肺泡气液界面的表面张力,避免液体外渗进入肺泡发生肺泡积液,保持肺中的液体平衡。它由大约70%至80%的PL组成,主要成分是DPPC,还有10%的SP-A、B、C和D(肺表面活性蛋白A、B、C、D)以及10%的中性脂质[4]。DPPC已被证明可以调节肺部炎症反应[14],但在高氧肺损伤中的作用研究较少。本实验中,高氧12 h后,DPPC产量开始下降,24 h DPPC产量达到峰值,说明适度的自噬能够调节AECII细胞加强功能,产生更多的表面活性物质以保护高氧对肺泡的损伤。但高氧48 h后,DPPC产量再次下降,72 h DPPC产量仍在较低值。说明内质网自噬代偿调节能力已达到极限,AECII产生DPPC的能力不再恢复。

内质网自噬的主要功能是降解多余的内质网膜以及有毒的蛋白聚集体,从而控制内质网体积,维持细胞稳态[15]。同时也是宿主细胞清除内质网中病毒或细菌的一种积极防御机制,在维持内质网稳态中发挥重要作用[16]。哺乳动物细胞中存在多种内质网自噬相关受体,包括ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62[17]。ATL3特点是具有GTP 酶(GTPase)活性,并参与内质网的形态和结构变化[17]。CCPG1为细胞周期进展基因1,通过去除部分携带不溶性蛋白的内质网,局部限制内质网应激,以维持内质网蛋白稳态[18]。在正常生理状态下,FAM134B 蛋白通过调节内质网周转参与细胞内稳态[19]。了解内质网自噬受体对于揭示内质网自噬的生理意义至关重要。而在某些环境下,如内质网应激、营养缺乏、错误折叠蛋白的积累或病原体攻击时,内质网自噬水平显著增加[17]。在本研究中,CCPG1、FAM134B在mRNA水平表达最为敏感,与高氧12 h相比,高氧24 h CCPG1、FAM134B mRNA水平显著上调,但CCPG1、FAM134B在蛋白水平并未升高,这可能与转录后翻译的时间不一致有关。

内质网自噬与多种疾病的发生发展相关,包括神经退行性病变、过敏性鼻炎、恶性肿瘤、糖尿病及传染性疾病等[20-22]。相关研究表明,细胞自噬是一种保护机制,以防止高氧引起的内皮细胞损伤,使用自噬激动剂可以缓解过度氧化引起的变化并起到保护作用[23]。ZHANG等[24]发现高氧24 h通过JNK信号介导的Atg7上调引发自噬,导致SP-C在AECⅡ中积累,本实验结果与其类似。在高氧环境下AECⅡ内质网自噬在12 h时开始下降,表面活性物质产生功能也随之下降;当在高氧环境下24 h时,AECⅡ内质网自噬反应恢复到基础水平,可能由于内质网自噬发生代偿的原因DPPC的产量明显增加;高氧48 h后,AECⅡ内质网自噬再次下降,由于内质网自噬无法持续代偿,导致DPPC的产量下降。

综上,本实验结果表明,高氧环境12 h ACEⅡ内质网自噬水平与DPPC产量同时下降,24 h ACEⅡ内质网自噬水平代偿上调恢复到基础水平,且ACEⅡ中DPPC产量达到最高,48 h后内质网自噬水平与DPPC产量再次下降,72 h内质网自噬水平与DPPC产量仍保持较低水平。内质网自噬与ACEⅡ细胞功能密切相关,临床高浓度氧疗时间不宜超过24 h。