冠心病患者微小RNA及外周血T细胞表达对斑块稳定性的影响

齐贵彬,高建步,张明磊,张永杰,王 星,解莉莉,李京倡,刘 琳

(河南大学附属南阳市中心医院 心血管内科,河南 南阳473009)

动脉粥样硬化主要累及大、中动脉,是一种慢性血管炎性疾病[1]。目前研究认为,动脉粥样硬化的主要病理机制为血管内皮功能异常导致血管壁粥样硬化斑块沉积,引发血管狭窄和闭塞[2]。微小RNA(miRNA,miR)能够诱发血管平滑肌细胞向增殖状态转化,同时促进血管平滑肌细胞向内膜迁移,参与动脉粥样硬化斑块的形成和发展[3]。近年来动物实验中发现的可能与动脉粥样硬化有关的3种miRNA包括miR-126、miR-221、miR-155[4]。CD4+调节性T细胞在维持免疫平衡状态方面发挥重要作用,细胞高表达的CD25+Foxp3+是CD4+调节性T细胞特异性标志[5]。脂质核心、表面内皮、外周纤维帽共同构成了动脉粥样硬化斑块,可分为脂质成分较少,周围以胶原组织和平滑肌细胞为主的稳定斑块;以及脂质松软且较多,斑块纤维帽很薄,平滑肌细胞较少的不稳定斑块[6]。动脉粥样硬化斑块的稳定性直接影响到冠心病患者继发性血栓的形成风险,因此本研究探讨冠心病患者miR-126、miR-221、miR-155及外周血T细胞表达对斑块稳定性的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年2月至2020年6月间河南大学附属南阳市中心医院心内科收治的冠心病患者138例。入选标准:冠状动脉造影显示1支及以上的主要冠脉狭窄程度达到III级。排除标准:①有PCI手术、球囊扩张术治疗史的患者;②合并感染性疾病,自身免疫性疾病,恶性肿瘤,肝、肾功不全的患者。其中男性90例,女性48例;年龄49～67岁,平均年龄(57.28±6.50)岁。选取健康志愿者60例为对照组,男性41例,女性19例;年龄48～65岁,平均年龄(56.94±5.63)岁。一般资料在各组间比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。此项研究经医院伦理委员会审批通过,患者的家属签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1血管内超声检查 向冠脉造影显示的管腔直径狭窄程度50%及以上的冠脉中注入200U硝酸甘油,使用超声诊断仪和冠脉超声成像导管,在X线透视下将超声探头导管沿着导引丝放入冠脉。到冠脉狭窄病变处远端,以0.5 mm/s的速度回撤超声探头导管,采集影像数据,通过虚拟组织学技术评价斑块性质,将冠心病患者分为稳定斑块组56例,不稳定斑块组82例。

1.2.2外周循环miR-126、miR-221、miR-155检测 采集冠心病患者和对照组受试者清晨空腹外周静脉血6 ml,抗凝处理后取其中4 ml分离血清和血浆,-80℃保存待测。采用实时荧光定量PCR技术检测血浆miR-126、miR-221、miR-155表达水平,PCR扩增引物由上海一研生物科技有限公司设计合成。miR-126上游引物:5′-TAATAATGAGTGCCATGCTGAGCTC-3′,下游引物:5′-GTAATACAGTGCCATGCTTTCGAA-3′。miR-221上游引物:5′-GG AACCTGCCATAACGGACAGTCACTTTAT-3′,下游引物:5′-GAGAGCTATAA AGGCGCCACTACTATTTGA-3′。miR-155上游引物:5′-TAGAGACGGGGCG GAGACGAGCTA-

GTAA-3′,下游引物:5′-AGTATATAACCTTGTAACATTTGG TATAG-3′。人snRNAU6(内参)上游引物:5′-TGGAGCCTGGGACGTGACCAG -3′,下游引物:5′-CGACGGCTTCGCTCGTGGGGCT-3′。PCR扩增参数:95℃ 预变性5 min、95℃ 变性30 s、60℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30个循环。计算miR-126、miR-221、miR-155的相对表达量。

1.2.3外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞检测 取另外2 ml抗凝处理后的空腹外周静脉血,Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞,除去黏附细胞后得到总T细胞,光学显微镜下调整细胞密度为1×105个/ml,使用PerCP-抗CD3、FITC-抗CD4、PE-抗CD25标记T细胞,4℃静置30 min,使用含10%胎牛血清的磷酸缓冲液洗涤3次,加入1 ml磷酸缓冲液重悬,CD3+设门,流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+细胞的比例。

1.2.4血脂4项和血清γ干扰素(IFN-γ)水平测定 取血清标本,全自动生化分析仪测定总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇水平,检测试剂购于美康生物科技有限公司;酶联免疫吸附法检测血清IFN-γ水平,试剂盒购于北京迈瑞达科技有限公司。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组miR-126、miR-221、miR-155表达水平比较

miR-126、miR-221、miR-155表达水平在对照组、稳定斑块组、不稳定斑块组之间比较差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,稳定斑块组、不稳定斑块组患者miR-126表达水平明显降低,miR-221、miR-155表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);不稳定斑块组患者miR-126表达水平明显低于稳定斑块组,miR-221、miR-155表达水平明显高于稳定斑块组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组miR-126、miR-221、miR-155表达水平比较

2.2 各组CD4+调节性T细胞及IFN-γ水平比较

CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+细胞的比例、血清IFN-γ水平在对照组、稳定斑块组、不稳定斑块组之间比较差异均有统计学意义(P<0.01);与对照组相比,稳定斑块组、不稳定斑块组患者CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+细胞的比例明显降低,血清IFN-γ水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);不稳定斑块组患者CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+细胞的比例明显低于稳定性斑块组,血清IFN-γ水平明显高于稳定性斑块组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组CD4+调节性T细胞及IFN-γ水平比较

2.3 各组血脂水平比较

与对照组相比,稳定斑块组、不稳定斑块组患者总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平明显升高,高密度脂蛋白胆固醇水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);不稳定斑块组患者总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平明显高于稳定斑块组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组血脂水平比较

2.4 冠心病患者miR-126、miR-221、miR-155表达水平与血脂4项和CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞占CD4+细胞比例的相关性分析

Pearson相关性分析显示,冠心病患者miR-126表达水平与总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平呈负相关,与CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞占CD4+细胞的比例呈正相关。冠心病患者miR-221、miR-155表达水平与总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平呈正相关,与CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞占CD4+细胞比例呈负相关。见表4。

表4 冠心病患者miR-126、miR-221、miR-155表达水平与血脂4项的相关性分析

2.5 冠心病患者CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞占CD4+细胞的比例与血脂4项的相关性分析

Pearson相关性分析显示,冠心病患者CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞占CD4+细胞的比例与总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇水平无明显相关性(r=-0.265、-0.207、-0.319、0.224,均P>0.05)。

3 讨论

相关研究显示,血管内皮细胞中miR-126高表达与血管重塑明显相关,能够调控单核细胞趋化蛋白、血管细胞黏附因子等靶基因的表达[7]。在大脑中动脉闭塞大鼠模型中血清miR-126表达水平明显降低[8]。研究认为miR-221的生物学功能存在细胞特异性,在血管内皮细胞中能够抑制细胞增殖和凋亡,但在血管平滑肌细胞中能够促进细胞增殖和凋亡[9]。血管内皮细胞中miR-221高表达与血管重塑明显相关,能够调控单核细胞趋化蛋白等靶基因表达,促进不稳定斑块的形成[10]。miR-155与免疫系统功能和内皮细胞炎性应答明显相关,其高表达能够抑制内皮细胞一氧化氮合酶(NOS)生成,进而降低血管内皮的舒张功能,促进动脉粥样硬化斑块形成[11]。对动脉粥样硬化小鼠模型研究显示,敲除miR-155后能够明显缩小硬化斑块,抑制不稳定斑块形成[12]。本研究结果显示,稳定斑块组、不稳定斑块组患者miR-126表达明显降低,miR-221、miR-155表达明显升高;其中不稳定斑块组患者改变较稳定斑块组更明显。提示miR-126低表达,miR-221、miR-155高表达可能促进不稳定斑块的形成。

慢性炎症反应贯穿动脉粥样硬化发生、发展至不稳定斑块形成的整个过程[13]。本研究结果显示,稳定斑块组、不稳定斑块组患者CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+细胞的比例明显低于对照组,不稳定斑块组患者CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+细胞的比例明显低于稳定斑块组。提示CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的免疫调控机制参与冠心病患者动脉粥样硬化斑块形成过程。近年来对动脉粥样硬化炎性反应的T细胞研究发现,IFN-γ作为免疫活化因子,在动脉粥样硬化发生与进展过程中起着重要作用,包括促进巨噬细胞分化,抑制内皮细胞增长、平滑肌细胞的胶原合成等[14]。本研究中稳定斑块组、不稳定斑块组患者血清IFN-γ水平明显高于对照组;不稳定斑块组患者血清IFN-γ水平明显高于稳定斑块组。提示IFN-γ分泌量增加可能是影响斑块稳定性的一个重要因素。相关性分析显示,冠心病患者miR-126表达水平与CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞占CD4+细胞的比例呈正相关;miR-221、miR-155表达水平与CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞占CD4+细胞比例呈负相关。提示miR-126可能正向调节CD4+调节性T细胞表达,miR-221、miR-155负向调节CD4+调节性T细胞表达,进而通过调节性T细胞的免疫抑制作用来降低冠脉中斑块的炎症反应,减缓斑块向不稳定状态的进展。

相关研究显示,斑块稳定性与内部脂质含量水平密切相关,降低LDL-C水平能够有效稳定斑块[15]。本研究结果显示,稳定斑块组、不稳定斑块组患者总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平明显高于对照组,不稳定斑块组患者总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平明显高于稳定斑块组,与上述研究结论一致。相关性分析显示,冠心病患者miR-126表达水平与总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平呈负相关;miR-221、miR-155表达水平与总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平呈正相关。提示miR-126、miR-221、miR-155在影响血管内皮细胞、单核细胞趋化蛋白、血管细胞黏附因子、调节性T细胞等表达同时,还可能通过影响冠心病患者的血脂水平来影响斑块稳定性,具体的分子通路仍需进一步深入研究。