首批HEK293细胞DNA含量测定国家标准品的制备

王光裕，杨靖清，魏长龙，周泽鑫，杨志行，黄钰，周勇

1.中国食品药品检定研究院药品监管科学全国重点实验室，北京 100050；2.广州派真生物技术有限公司，广东 广州 510670；3.湖州申科生物技术有限公司，浙江 湖州 313000；4.武昌首义学院，湖北 武汉 430064

随着生物医药技术的飞速发展，越来越多的哺乳动物细胞，尤其是连续传代细胞系用于生产疫苗和治疗性生物制品。常用的生产用细胞包括中国仓鼠卵巢细胞（CHO 细胞）、非洲绿猴肾细胞（Vero 细胞）、小鼠骨髓瘤细胞（NS0 细胞）以及HEK293 细胞等，这些传代细胞作为宿主，可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其他病理变化，存在安全性问题，因此，对其残余DNA 含量需进行严格控制［1］。前期中国食品药品检定研究院已制备并发布了E.coli、CHO 细胞、Vero 细胞以及NS0 细胞DNA 标准品用于宿主DNA 的含量测定，为促进行业同类物质的定值统一发挥了积极作用［2-5］。

近年基因治疗药物发展较快，其中许多以腺相关病毒（adenovirus-associated virus，AAV）为载体的基因治疗药物所用的宿主细胞为HEK293细胞［6］，由于以三质粒-HEK293 细胞系统制备的AAV 产品，其产毒过程并非病毒天然的包装方式，病毒衣壳会包裹较多的宿主DNA 片段，因此，对制品中残余宿主DNA 进行检测并制定合理的限度标准显得格外重要，国家药品审评中心与美国FDA 在相关指南文件中建议将宿主残留DNA 控制在10 ng／剂以下［7-8］，为了对残余HEK293 细胞DNA 进行准确定量，需建立统一的定量标准物质。基于此，市面上已有多个厂家采用荧光定量PCR 技术，开发了相应的检测试剂盒，但由于各试剂盒中所用的DNA 标准品来源不一，采用不同试剂盒对同一产品进行检测时，定值结果差异较大，不同产品以及同一产品不同批次之间的宿主DNA 定量结果难以比较。为此，本研究研制了1 批HEK293 细胞DNA 含量测定用国家标准品，以期为行业内HEK293 细胞残余DNA 的测定提供支持。

1 材料与方法

1.1 细胞 HEK293细胞来自ATCC（CRL-1573）。

1.2 主要试剂及仪器 基因组DNA提取试剂购自德国QIAGEN 公司（Genomic-tip 500／G）；TE 缓冲液（pH 8.0，10 mmol／L）由广州派真生物技术有限公司配制（000002-02）；Human残留DNA 检测试剂盒购自中国湖州申科生物技术有限公司（SK030207H100）；CF40 细胞工厂购自飞凡应用生物科技（广州）有限公司；紫外可见分光光度计购自日本岛津公司（UV-2700）；荧光定量PCR仪分别购自瑞士罗氏公司（Light-Cycler 480）和美国Applied Biosystems 公司（QuantStudio™7 Flex）。

1.3 标准品的制备 取2 支HEK293 细胞种子，复苏后传代5次，转移至3个CF40细胞工厂，当汇合率达85%以上时，将细胞消化并合并到无菌离心杯中。4 ℃，1 500×g离心10 min，弃上清，用预冷的PBS 以相同条件清洗3次，将细胞密度调整为1.1×107个／mL，按10 mL／管分装于50 mL离心管中。

采用Genomic-tip 500／G 试剂盒提取每管细胞DNA，每10 mL 细胞悬液加入10 mL Buffer C1 和30 mL蒸馏水，上下颠倒混匀后冰上放置10 min；4 ℃，1 300×g离心15 min，弃上清，加入2 mL Buffer C1和6 mL蒸馏水，于混匀仪上涡旋，再次4 ℃，1 300×g离心15 min，弃上清，加入10 mL Buffer G2，涡旋30 s 后至完全混匀；加入0.2 mL蛋白酶K，50 ℃孵育60 min，同时将纯化柱放置在管上，加入10 mL Buffer QBT 进行平衡。将孵育结束的裂解液涡旋10 s后，4 ℃，5 000×g离心10 min，将上清转移至纯化柱中至液体完全流出，用15 mL Buffer QC 清洗2 次后，将纯化柱置于干净的离心管中，加入50 ℃预热的15 mL Bu-ffer QF 洗脱DNA。将洗脱液加入10.5 mL异丙醇，上下颠倒后进行DNA沉淀，4 ℃，5 000×g离心15 min，弃上清，加入4 mL 70%乙醇，涡旋后4 ℃，5 000×g离心15 min，弃上清，在洁净工作台中风干10 min；加入TE 缓冲液，55 ℃孵育2 h 溶解DNA。采用紫外分光光度计测定纯化DNA 的浓度和纯度［9］，将其中A260／A280在1.8 ～2.0 之间、DNA 浓度大于200 ng／μL 以及经DNA凝胶电泳检测电泳条带单一的管进行合并。

将所有符合要求的DNA 母液混合，3 200 ×g离心5 min，取上清，用TE 缓冲液稀释至浓度约为100 ng／μL，按160 μL／支分装于0.5 mL 无菌可立螺帽管（带O 型垫圈）中，分装量按照2 000 支计划。标准品制备完成后按100支／盒包装，-80 ℃保存。

1.4 标准品的检定 取9 个分装盒中各1 支样品，首先采用紫外分光光度法测定A260和A280值，其中A260值应在0.3 ～0.6 之间；采用A260和A280的比值评估纯度，其比值应在1.8 ～2.0 之间；通过A260值计算含量，依照《中国药典》三部（2020 版）通则3704“外源性DNA 残留量测定法”中公式［10］，即：DNA 浓度（μg／mL）=稀释倍数×50×A260，管间浓度相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）应小于3.00%。随后进行0.7%琼脂糖凝胶电泳，每个样品电泳条带应保持单一。

1.5 标准品的协作标定 组织5家不同实验室，采用紫外分光光度法对制备的标准品进行协作标定。每家实验室至少测定5 份样品，每个样品测定3 次A260和A280值。其中A260值应在0.3 ～0.6 之间；A260／A280应在1.8 ～2.0 之间；通过A260值计算含量，即：DNA浓度（μg／mL）=稀释倍数×50×A260。

将每家实验室测得的实际浓度汇总，结果统一保留至小数点后2 位，带入1.4 项中公式进行计算，将计算后的原始浓度结果经Jarque-Bera检验进行统计分析，并求出加权均值、RSD、可信区间、参考值范围及平均可信限率。

1.6 标准品的稳定性分析 将制备的标准品分别于不同温度（-80、-20、4、25、37 ℃）下储存2、6、8 周后，分别进行紫外浓度测定及DNA凝胶电泳纯度分析。

1.7 标准品的适用性分析 分别使用罗氏和Applied Biosystems 荧光定量PCR 仪对制备的HEK293细胞DNA 国家标准品进行荧光定量PCR 检测，确定线性范围和定量限。用TE 缓冲液将DNA 标准品稀释至300 pg／μL 作为起始浓度，再进行4 次10 倍稀释至0.03 pg／μL，共5个稀释度，每个稀释度设3个复孔，以其为模板进行荧光定量PCR 反应，引物探针及反应mix均采用湖州申科生物技术有限公司试剂盒，反应总体积30 μL，其中模板上样量10 μL。扩增程序如下：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40个循环。每个循环在60 ℃退火时采集信号。

1.8 数据采集及分析 标准品制备过程中质量评价、协作标定和适用性验证结果作图采用GraphPad Prism 5.01 软件；协作标定数据统计分析采用PTP／RMP软件（版本号：BMV V1.0；2021-1030）。

2 结果

2.1 标准品的质量 抽提的110 管HEK293 细胞基因组DNA 浓度和A260／A280见图1，筛选DNA 浓度大于200 ng／μL 且A260／A280在1.8 ～2.0 之间的管，共得到104 管。0.7%琼脂糖凝胶电泳分析显示，各条带均一，见图2。

图1 紫外分光光度法测定HEK293细胞DNA 浓度（A）及A260／A280（B）结果Fig.1 Determination of DNA concentration（A）and A260／A280（B）in HEK293 cells using UV spectrophotometry

图2 抽提的HEK293细胞DNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of DNA extracted from HEK293 cells

2.2 标准品的检定 不同分装盒中的9 支样品紫外浓度的RSD为1.6%，纯度（A260／A280）的RSD为0.6%，见表1。9支样品电泳条带均一，见图3。

表1 HEK293细胞DNA浓度与纯度检定结果Tab.1 HEK293 cell DNA concentration and purity results

图3 HEK293细胞DNA琼脂糖凝胶电泳检定结果Fig.3 DNA agarose gel electrophoresis results of HEK293 cells

2.3 标准品的协作标定 共得到78 个有效浓度结果，见表2。经Jarque-Bera检验，P＞0.05，具备正态性，在PTP／RMP 软件中计算其加权平均值为104.8 ng／μL，RSD为4.2%，均数的95%可信区间为103.8 ～105.8 ng／μL。单次测定的95%参考值范围为96.0 ～113.6 ng／μL，平均可信限率（%）=t（77）0.05× 标准误／均数× 100% = 1.0%。5 家实验室协作标定结果分析见图4。

表2 HEK293 细胞DNA 含量测定国家标准品协作标定结果（ng／μL）Tab.2 Collaborative calibration results of national reference standard for HEK293 cell DNA content determination（ng／μL）

图4 HEK293 细胞DNA 含量测定国家标准品协作标定结果分布图Fig.4 Distribution diagram of collaborative calibration results of national reference standard for HEK293 cell DNA content determination

2.4 标准品的稳定性 凝胶电泳法纯度检测结果显示，在4 个温度条件下保存8 周，基因组DNA 未发生明显降解，见图5。但随着温度升高与保存时间的延长，标准品DNA 浓度呈升高趋势，即使-20 ℃保存，8 周后测定结果也出现偏高的情况，而-80 ℃保存样品含量测定结果稳定，见表3。因此推荐保存条件为-80 ℃。

表3 不同温度保存条件下浓度测定结果（ng／μL）Tab.3 Content determination results under different temperature storage conditions（ng／μL）

图5 不同温度保存条件下凝胶电泳结果Fig.5 Results of gel electrophoresis under different temperature storage conditions

2.5 标准品的适用性 分别使用罗氏和Applied Biosystems 荧光定量PCR 仪对制备的DNA 标准品进行荧光定量PCR测定，在0.3 ～3 000 pg／反应范围内扩增曲线平滑，见图6。标准曲线见图7，采用罗氏仪器时，斜率为-3.295，扩增效率为101%，R2为0.999 2；采用Applied Biosystems 仪器时，斜率为-3.439，扩增效率为95%，R2为0.999 5。表明标准品适用性良好。

3 讨论

宿主细胞DNA残留具有生物安全风险，重组AAV制品多采用HEK293 细胞制备，需对其定量控制。目前不同实验室的qPCR 方法结果差异较大，其中重要原因就是缺少统一的DNA 标准物质。基于以上背景，本研究以HEK293 细胞基因组DNA 为原料，成功制备了我国首批HEK293 细胞DNA 国家标准品。通过紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳分析，该标准品的纯度符合要求。经5 家实验室共同完成协作标定，该标准品的平均含量为104.8 ng／μL，RSD为4.2%，均数的95%可信区间为103.8 ～105.8 ng／μL。单次测定的95%参考值范围为96.0 ～113.6 ng／μL，平均可信限率为1.0%。该标准品的批号为270039-202301。加速热稳定性试验结果显示，在-80 ℃条件下，该标准品能够长期保持稳定性，后续将继续进行长期稳定性考察。采用荧光定量PCR 法对该标准品进行适用性研究，结果表明，其能够满足要求，适用性良好，可用于HEK293细胞DNA含量的定量检测。