高浓度重链抗体可变区-Fc融合蛋白稳定性影响因素分析

饶金瑞，王永红，沈智勇，赵黎明

1.华东理工大学生物工程学院，上海 200237；2.上海臻格生物技术有限公司，上海 201318

在骆驼科动物中存在天然缺失轻链和CH1结构域的重链抗体［1］，重链抗体可变区（variable domain of heavy-chain antibody，VHH）是一种相对分子质量约15 000 的单域抗体，其血浆半衰期仅为0.5 ～2 h，限制了在免疫治疗中的应用［2］。Fc片段可与新生Fc受体（neonatal Fc receptor，FcRn）结合，避免抗体被溶酶体降解，从而延长其血浆半衰期［3］。此外，Fc 片段的加入能够使融合蛋白具有更大的相对分子质量，避免其被肾小球滤过［4］。因此，常将VHH 与IgG（或IgA）的铰链区和Fc片段融合，以改善其药代动力学，同时使VHH 获得Fc 片段介导的多种效应器功能。VHH-Fc融合蛋白被广泛应用于肿瘤治疗、流感病毒中和等领域［5-6］。

蛋白类药物的理化性质比小分子药物更加复杂，蛋白质会由于其物理和化学不稳定性而发生降解。常见的化学降解途径有氧化、脱酰胺、断裂、异构化、糖化等，化学降解会对抗体的结构和功能产生不同的影响，这与其发生的位置有关，如CDR区域的色氨酸氧化会降低抗原结合活性［7］，Fc 片段上的氧化会影响抗体与新生Fc 受体和Fcγ 受体（Fcγ receptor，FcγR）的结合活性［8-9］。聚集是蛋白质最主要的物理不稳定性，聚体的形成可能会增加蛋白类药物的免疫原性［10］。

皮下注射能够方便慢性疾病患者进行自我给药，而由于组织压力和注射疼痛等问题，单次注射药量一般不超过2 mL，为达到治疗所需药物剂量，皮下注射蛋白类药物的浓度通常大于100 mg／mL［11］，这使得其面临更为严峻的稳定性挑战。此外，生产、运输和储存过程中产生的机械应力（如剪切力）和外界环境条件（如温度、光照）的变化也会影响蛋白类药物的稳定性［12］，因此稳定性研究是蛋白类药物研发过程中的重要环节。强制降解试验是通过施加应力条件来揭示蛋白类药物可能存在的降解途径，是研究药物稳定性的重要工具［13］。本研究探讨了3 种强制降解条件（振摇、光照和40 ℃高温）对高浓度VHH-Fc 融合蛋白稳定性的影响，以期为后续的制剂开发和稳定性分析提供依据。

1 材料与方法

1.1 融合蛋白VHH-Fc融合蛋白由上海臻格生物技术有限公司提供。

1.2 主要试剂及仪器 氢氧化钠购自上海国药化学试剂有限公司；Tergazyme 购自美国ALCONOX 公司；胰蛋白酶购自美国Promega 公司；盐酸胍、Tris、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAM）、尿素、甲酸（FA）购自美国Sigma-Aldrich 公司；Sartoflow®Smart型超滤系统购自德国Satorius 公司；OS010T12 型超滤膜包购自美国Pall公司；SHP-080型生化培养箱购自上海精宏实验设备有限公司；Esco B2 型生物安全柜购自新加坡ESCO 公司；PR-002 型DSF 检测仪购自德国Nano Temper 公司；Plate ReaderⅢ型高通量动态光散射仪购自美国Wyatt 公司；Dionex UltiMate 3000 型高效液相色谱仪、Q Exactive MS 型质谱仪、Megafuge ST1R Plus 型离心机均购自美国Thermo 公司；ACQUITY UPLC Peptide BEH C18（300 Å，1.7 μm，2.1 mm×5 mm）购自美国Waters公司；NAP-5柱购自美国Cytiva公司。

1.3 高浓度VHH-Fc 融合蛋白样品制备 用Sartoflow®Smart型超滤系统浓缩VHH-Fc 融合蛋白，上样流速为100 mL／min，TMP 为1 bar，超滤膜包型号为OS010T12，将纯化后VHH-Fc 融合蛋白最终浓缩至100 mg／mL。在生物安全柜中使用0.22 μm 滤膜对浓缩后的VHH-Fc 融合蛋白进行除菌过滤并分装于西林瓶中，留取3 瓶分装好且未经强制降解处理的样品作为对照组（0 d），之后进行相应的强制降解试验样品放置。

1.4 强制降解试验样品放置

1.4.1 振摇试验样品放置 将分装于西林瓶内样品置恒温培养摇床中，25 ℃，200 r／min 避光振摇3、5、7、10 d，按照上述时间点取样并进行检测。

1.4.2 光照试验样品放置 将分装于西林瓶内样品置恒温恒湿箱中。根据ICH 的Q1B 光稳定性试验指导原则，设置照度为5 000 lx，以确保光照10 d 总照度不低于1.2 × 106lx·h，近紫外能量200 W·h／m2，25 ℃光照3、5、7、10 d，按照上述时间点取样并进行检测。

1.4.3 40 ℃高温试验样品放置 将分装于西林瓶内样品置生化培养箱中，40 ℃放置7、14 d，按照上述时间点取样并进行检测。

1.5 强制降解条件对高浓度VHH-Fc 融合蛋白构象稳定性影响的检测

1.5.1 构象展开起始温度（onset temperature of unfolding，Tonset）及熔解温度（melting temperature，Tm） 采用差式扫描荧光法检测［14］。用纯化洗脱液将样品稀释至10 mg／mL，取20 μL样品加至微孔板中，887.4×g离心3 min 以去除样品中的气泡。设置DSF 检测仪温度变化范围为25 ～95 ℃，升温速率1 ℃／min，用仪器配套Stability Analysis 软件进行数据分析得出样品Tonset和Tm。

1.5.2 起始聚集温度（aggregation onset temperature，Tagg） 采用动态光散射（dynamic light scattering，DLS）法检测［15］。用纯化洗脱液将样品稀释至10 mg／mL，9 503×g离心10 min；取15 μL加至微孔板中，887.4×g离心3 min 以去除样品中的气泡。微孔板封膜后进行DLS 检测，设置温度变化范围为25 ～85 ℃，升温速率1 ℃／min，用仪器配套DYNAMICS 软件拟合数据得出样品Tagg。

1.6 强制降解条件对高浓度VHH-Fc 融合蛋白胶体稳定性影响的检测 采用DLS 法检测扩散相互作用系数（diffusion interaction parameter，kD）［16］。用纯化洗脱液将样品分别稀释至2、4、6、8、10 mg／mL，9 503 ×g离心10 min；取20 μL 加至微孔板中，每个浓度4 个平行重复，887.4×g离心3 min 以去除样品中的气泡。DLS检测温度为25 ℃，用仪器配套DYNAMICS软件拟合数据得出样品kD。

1.7 强制降解条件对高浓度VHH-Fc 融合蛋白平均水化动力学直径影响的检测 采用DLS 法检测平均水化动力学直径［17］。用纯化洗脱液将样品稀释至10 mg／mL，9 503×g离心10 min；取20 μL加至微孔板中，887.4 ×g离心3 min 以去除样品中的气泡。DLS 检测温度为25 ℃，用仪器配套DYNAMICS 软件处理数据得出样品平均水化动力学直径。

1.8 强制降解条件对高浓度VHH-Fc 融合蛋白翻译后修饰影响的检测

1.8.1 样品处理 用超纯水将样品稀释至10 mg／mL，取500 μg蛋白，加入188 μL变性缓冲液（8 mol／L盐酸胍，0.25 mol／L Tris，pH 7.5）和8 μL DTT（0.5 mol／L），再加入超纯水至250 μL，混匀，37 ℃水浴30 min；加入25 μL IAM（0.5 mol／L），混匀，室温避光反应30 min 以实现样品的烷基化。用超纯水和酶切缓冲液（2 mol／L 尿素，0.1 mol／L Tris，pH 7.5）平衡NAP-5 柱［18］，取250 μL 烷基化样品加入平衡后NAP-5 柱，静置至上样完成，加入450 μL 酶切缓冲液，静置至上样完成，再加入450 μL 酶切缓冲液，用EP 管收集流出液。取100 μL 流出液，加入8 μL 胰蛋白酶（0.5 mg／mL）吹打混匀，37 ℃水浴4 h；加入1 μL FA终止反应。

1.8.2 超高效液相色谱-质谱（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）法检测

1.8.2.1 UPLC条件 色谱柱为ACQUITY UPLC Peptide BEH C18（300 Å，1.7 μm，2.1 mm×5 mm）［19］；流动相A为去离子水，含0.1%FA；流动相B为乙腈，含0.1%FA；参数设置如下：样品盘温度6 ℃；柱温60 ℃；上样体积10 μL；流速0.3 mL／min；检测波长214 nm。采用梯度洗脱，洗脱条件见表1。

表1 UPLC梯度洗脱条件Tab.1 UPLC gradient elution conditions

1.8.2.2 质谱条件 分析时长：110 min；扫描方式：正离子扫描；一级质谱扫描范围：300 ～2 000 m／z；分辨率：70 000；自动增益控制：3 e6；最大驻留时间：100 ms；扫描范围数：1；动态排除：4.0 s；二级质谱扫描范围：200 ～2 000 m／z；分辨率：17 500；最大驻留时间：100 ms。

1.8.2.3 数据处理 用Pepfinder 2.0 软件将质谱数据与高浓度VHH-Fc 融合蛋白理论氨基酸序列匹配以鉴定主要修饰种类及位点，用Xcalibur 4.0 软件对不同酶切肽段（含修饰肽段）的色谱峰面积进行相对定量比较，确定修饰比例。

1.9 统计学分析 实验样品均至少重复测定3 次。使用Excel 2019 软件进行数据记录及整理，Origin Pro 2021 软件绘图，IBM SPSS Statistics 26 软件进行统计学分析，两组间比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 强制降解条件对高浓度VHH-Fc 融合蛋白构象稳定性的影响

2.1.1 Tonset及Tm对照组Tonset为61.4 ℃，3 种强制降解条件下，Tonset均随时间增加而降低。光照3、5、7、10 d 后，Tonset分别降低至58.0、54.5、53.3、50.2 ℃，与对照组相比，差异有统计学意义（t分别为28.012、47.260、49.602、52.968，P均为0.000）。振摇3和5 d时，与对照组间相比，Tonset差异无统计学意义（t分别为1.437、2.750，P分别为0.224、0.051）；振摇7 和10 d后，Tonset显著低于对照组（t分别为4.899、8.000，P分别为0.008、0.001）；振摇10 d后，Tonset降低了1.1 ℃。40 ℃高温放置7和14 d后，Tonset显著低于对照组（t分别为3.062、4.323，P分别为0.038、0.012）。

对照组Tm1为65.9 ℃，3种强制降解条件下，Tm1均随时间增加而降低。光照3、5、7、10 d后，Tm1分别降低至63.9、61.5、60.4、57.7 ℃，与对照组相比，差异有统计学意义（t分别为16.364、36.888、46.040、67.951，P均为0.000）。振摇3和5 d时，与对照组相比，Tm1 差异无统计学意义（t分别为1.250、2.524，P分别为0.279、0.065）；振摇7和10 d后，Tm1显著低于对照组（t分别为6.197、7.112，P分别为0.003、0.002）；振摇10 d后，Tm1降低了1.0 ℃。40 ℃高温放置7 d后，Tm1显著低于对照组（t=4.250，P=0.013），高温放置14 d 后，Tm1 降低了0.8 ℃（t= 5.735，P=0.005）。对照组Tm2为82.7 ℃，光照7和10 d后，Tm2显著低于对照组（t分别为4.596、7.273，P分别为0.010、0.002），光照10 d 后，Tm2 降低了0.8 ℃。振摇和40 ℃高温条件下，与对照组相比，各时间点Tm2差异无统计学意义（振摇3 d：t= 0.354，P= 0.742；振摇5 d：t= 0.905，P= 0.417；振摇7 d：t= 1.061，P=0.349；振摇10 d：t=1.581，P=0.189。40 ℃放置7 d：t= 0.302，P= 0.778；40 ℃放置14 d：t= 2.475，P=0.069）。见图1。

图1 不同强制降解条件对高浓度VHH-Fc融合蛋白Tonset和Tm的影响Fig.1 Effects of different forced degradation conditions on Tonset and Tm of high concentration VHH-Fc fusion protein

2.1.2 Tagg对照组Tagg为67.9 ℃，3 种强制降解条件下，Tagg均随时间增加而降低。光照3、5、7、10 d 时，Tagg均显著低于对照组（t分别为8.175、18.337、24.140、21.461，P分别为0.001、0.000、0.000、0.000），光照10 d后，Tagg降低了6.6 ℃。振摇和40 ℃高温条件下，与对照组相比，各时间点Tagg差异有统计学意义（振摇3 d：t= 5.761，P= 0.005；振摇5 d：t= 6.440，P=0.003；振摇7 d：t= 6.310，P= 0.003；振摇10 d：t=11.071，P=0.000。40 ℃放置7 d：t=8.455，P=0.001；40 ℃放置14 d：t= 18.207，P= 0.000），但降低幅度均小于光照条件，因此，光照对高浓度VHH-Fc 融合蛋白的Tagg影响最大。见图2。

图2 振摇（A）、光照（B）、40 ℃高温（C）对高浓度VHH-Fc融合蛋白Tagg的影响Fig.2 Effects of shaking（A），light（B）and 40 ℃high temperature（C）on Tagg of high concentration VHH-Fc fusion protein

2.2 强制降解条件对高浓度VHH-Fc融合蛋白胶体稳定性的影响 对照组kD为10.40 mL／g，3 种强制降解条件下，kD均随时间增加而减小，逐渐变为负值。振摇10 d 后，kD减小至-34.90 mL／g，光照10 d后，kD减小至-3.27 mL／g，40 ℃高温放置14 d 后，kD减小至-7.89 mL／g。振摇条件下kD减小量最大，其次为40 ℃高温和光照。

2.3 强制降解条件对高浓度VHH-Fc 融合蛋白平均水化动力学直径的影响 3 种强制降解条件下，高浓度VHH-Fc 融合蛋白的平均水化动力学直径均随时间增加而增大。振摇3、5、7、10 d 时，与对照组相比，平均水化动力学直径差异有统计学意义（t分别为-25.684、-99.923、-159.174、-110.097，P均为0.000），振摇10 d 后，平均水化动力学直径增大至95.6 nm。光照和40 ℃高温条件下各时间点平均水化动力学直径与对照组间差异有统计学意义（光照3 d：t= -3.780，P= 0.019；光照5 d：t= -7.348，P=0.002；光照7 d：t= -10.752，P= 0.000；光照10 d：t= -10.660，P= 0.000；40 ℃放置7d：t= -13.598，P= 0.000；40 ℃放置14 d：t= -24.350，P= 0.000），但增大幅度均小于振摇条件。见图3。

图3 振摇（A）、光照（B）、40 ℃高温（C）对高浓度VHH-Fc融合蛋白平均水化动力学直径的影响Fig.3 Effects of shaking（A），light（B）and 40 ℃high temperature（C）on average hydrodynamic diameter of high concentration VHH-Fc fusion protein

2.4 强制降解条件对高浓度VHH-Fc 融合蛋白翻译后修饰的影响 与对照组相比，3 组强制降解试验结束时，翻译后修饰的类型及对应的修饰位点未发生变化。光照条件下，高浓度VHH-Fc 融合蛋白在Met34、Met83、Met160、Met266 处的氧化比例升高，其中Met160 和Met266 处氧化比例相较于对照组分别升高了70.25%和23.18%，表明这2 个位点的甲硫氨酸对光照敏感，易发生氧化。振摇条件下，高浓度VHH-Fc 融合蛋白的N-末端焦谷氨酸环化比例增加，40 ℃高温条件会升高其N-末端焦谷氨酸环化和Asp188 处异构化比例。3 种强制降解条件对脱酰胺及Asn205 处的糖基化修饰比例无明显影响。见表2。

表2 不同强制降解条件对高浓度VHH-Fc融合蛋白翻译后修饰的影响（%，±s，n=3）Tab.2 Effects of different forced degradation conditions on post-translational modifications of high concentration VHH-Fc fusion protein（%，±s，n=3）

表2 不同强制降解条件对高浓度VHH-Fc融合蛋白翻译后修饰的影响（%，±s，n=3）Tab.2 Effects of different forced degradation conditions on post-translational modifications of high concentration VHH-Fc fusion protein（%，±s，n=3）

肽段修饰位点修饰类型相对比例1 3 11 14 17 19 21 21 22 31 32 33 37 38 E1 M34 M83 W113 M160 D188 N205 N205 N223 M266 N269 N292 N342 K355 N-末端焦谷氨酸环化氧化氧化氧化氧化异构化G0F糖型G1F糖型脱酰胺氧化脱酰胺脱酰胺脱酰胺C-末端赖氨酸去除对照6.07±0.37 0.52±0.04 0.32±0.03 4.09±0.30 0.53±0.08 1.23±0.13 91.35±1.23 8.70±0.91 3.14±0.43 0.64±0.05 1.14±0.25 2.13±0.23 1.24±0.29 98.36±0.57振摇10 d 6.63±0.29 0.53±0.03 0.44±0.04 4.07±0.23 0.65±0.07 1.47±0.08 91.32±0.99 8.76±0.42 3.07±0.18 0.63±0.03 1.19±0.18 2.22±0.33 1.21±0.31 98.47±1.39光照10 d 6.33±0.32 6.12±0.37 0.83±0.06 4.34±0.24 70.78±2.09 1.25±0.05 91.44±0.60 8.63±0.67 3.15±0.22 23.82±0.61 1.03±0.21 2.32±0.28 1.21±0.32 98.44±0.53 40 ℃放置14 d 9.73±0.75 0.64±0.05 0.49±0.03 4.22±0.16 0.63±0.04 1.89±0.04 91.47±1.03 8.58±0.51 3.27±0.15 0.64±0.03 1.07±0.09 2.24±0.22 1.32±0.24 98.31±0.96

3 讨论

Tonset和Tm越高，抗体在热变性过程中去折叠所需温度越高，其构象稳定性也越高。抗体可能含有多个Tm，在人源化IgG1 单克隆抗体中不同的Tm对应不同结构域的构象展开［20］。构象稳定性高的抗体即使在较高温度下仍能以分散单体的形态存在而不发生聚集，Tagg描述了抗体热变性过程中由于形成较小可溶性聚体而导致其尺寸增大的温度，是衡量抗体构象稳定性的重要参数［21］。本研究Tonset、Tm和Tagg的变化趋势表明，光照对高浓度VHH-Fc融合蛋白的构象稳定性影响最大。

kD是研究蛋白质分子间弱相互作用的重要参数，能够用于预测蛋白质的胶体稳定性［21］。kD为正值，表示蛋白质分子间存在弱的相互排斥力，预示长期放置倾向稳定；kD为负值，表示蛋白质分子间存在弱的相互吸引力，蛋白质易发生自缔合，kD绝对值越大表明蛋白质分子间的力越大［22］。本研究结果显示，对照组样品kD为正值，表明蛋白质分子间存在弱的相互排斥力，胶体稳定性较好，3 种强制降解条件下，kD均随时间增加而减小，逐渐转变为负值，即蛋白质分子间由弱的相互排斥力转为弱的相互吸引力，胶体稳定性降低。振摇条件下kD减小量最大，表明振摇对高浓度VHH-Fc 融合蛋白的胶体稳定性影响最大。

DLS 法能够测定溶液分散体系中近似球形颗粒的平均尺寸-平均水化动力学直径［23］，其检测速度快，可实现对少量聚体的灵敏检测，适用于强制降解条件下监测蛋白质样品的尺寸变化［17］。本研究结果显示，振摇对高浓度VHH-Fc融合蛋白的聚集过程影响最大。

在紫外和可见光应力条件下，蛋白类药物中的甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸会发生氧化等化学降解［24］。抗体的聚集倾向可能受构象稳定性或胶体稳定性控制。ALAM 等［25］发现，甲硫氨酸氧化会导致单克隆抗体的构象稳定性显著降低，但对抗体聚集的影响很小。综上所述，本研究评估了振摇、光照和40 ℃高温3 种强制降解条件对高浓度VHH-Fc 融合蛋白稳定性的影响，光照会显著降低高浓度VHH-Fc融合蛋白的构象稳定性，这可能与光诱导的Met160和Met266 处的甲硫氨酸氧化有关；振摇会显著降低高浓度VHH-Fc融合蛋白的胶体稳定性并促进聚集。在后续制剂开发过程中，可通过添加蔗糖等辅料来保护高浓度VHH-Fc融合蛋白的构象稳定性，添加表面活性剂以减少剪切等机械应力诱导的聚集，并在生产、储存、运输过程中注意避光。