复方芩柏颗粒对溃疡性结肠炎大鼠Th1/Th2、Th17/Treg细胞稳态影响

洪译 王真权 罗雯鹏

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是以弥漫性、连续性病变为特征的慢性非特异性炎症性疾病,属于炎症性肠病范畴[1]。该病全球发病率逐年上升[2],已成为临床较难治愈的常见消化道疾病之一。针对UC的病因及发病机制仍未达成共识,目前已提出包括遗传、免疫学失调、微生物群失衡和环境触发等多种致病因素,其中较为公认的是与免疫功能障碍失调相关的免疫学说。

中医并无与UC相对应病名,临床根据患者症状分为“泄泻”“肠澼”等病。中医认为,UC病位在大肠,与脾胃、肝、肺等多脏腑相关。脾虚湿热蕴肠为基本病机,本虚标实为病性特点。多由饮食不节、外感六淫、情志失调[3]或禀赋不足所致。临床诊疗中发现大多UC发病与中医“湿热[4]”“瘀血[5]”“浊毒[6]” 等病理因素相关。

复方芩柏颗粒是我院多年来临床治疗UC的纯中药制剂,疗效确切,在防治UC的发生发展方面有其独特优势。前期已有研究显示,复方芩柏颗粒具有较强的抑菌抗炎作用,能够有效增强机体免疫力,且无明显毒副作用[7]。同时复方芩柏颗粒可促进UC大鼠肠道黏膜愈合,减轻肠道炎症反应,其机制可能是通过上调转化生长因子β1(transforming growth factor 1, TGF-β1)表达,调控辅助性T细胞(helper T cell)17/调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)细胞稳态平衡,并与用药浓度相关。该结果提示 Th17/Treg 可能是复方芩柏颗粒治疗 UC 的重要靶点[8-10]。本研究旨在证实复方芩柏颗粒对UC大鼠Th1/Th2、Th17/Treg细胞稳态的调节作用,探讨复方芩柏颗粒对溃疡性结肠炎的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠42只(动物质量合格证编号:422023100001662),SPF级,6～7周龄,体质量(230±15)g,购于湖北贝恩特生物科技有限公司,许可证号:SCXK(鄂)2021-0027,本次实验已通过动物实验伦理审查[编号:LACUC(准)- BNT-2022-002]。大鼠饲养于SPF级环境,饲养室温度(22±3)℃,相对湿度 50%～60%,12小时明暗交替,实验前适应性喂养7天。

1.2 实验药物、试剂及仪器

复方芩柏颗粒,组成:黄柏、槟榔、秦艽、防风炒炭、熟大黄、生地黄、当归尾、桃仁、延胡索、黄芩、泽泻,药物比例:黄柏∶黄芩∶泽泻∶当归∶槟榔∶秦艽∶防风∶熟大黄∶延胡索∶生地黄∶桃仁=4∶4∶4∶4∶3.5∶3.5∶3.5∶3.5∶3.5∶5∶2,规格:6 g/包,批号:湘药制字Z20080819,湖南中医药大学第二附属医院提供;美沙拉嗪肠溶片(黑龙江天宏药业股份有限公司生产,批号:20190109);葡聚糖酸钠(dextran sulfate,DSS)(Sigma,批号:PHL83846);粪便隐血检测试剂(远慕生物,批号YM-TC0511),二甲苯(国药,批号:10023418);无水乙醇(国药,批号:10009259);苏木素—伊红染液(三鹰,批号:B600020);CD4流式抗体(biolegend,批号:201505);干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)流式抗体(Cell Signaling,批号:62675S);白介素(interleukin,IL)-4流式抗体(biolegend,批号:511905);IL-17A流式抗体(Invitrogen,批号:12717781);CD25流式抗体(biolegend,批号:202113);叉头状转录因子3(forkhead box protein P3,FoxP3)流式抗体(biolegend,批号:320007);荧光定量PCR MasterMix(TSINGKE,批号:TSK201);BCA蛋白定量试剂盒(碧云天,批号:P0009);ECL底物发光试剂盒(武汉聚能译通,批号:K-12043-D10);SDS聚丙烯酰胺分离胶(Solarbio,批号:S8010);HRP标记山羊抗兔(武汉三鹰,批号:SA00001-2);HRP标记山羊抗小鼠(武汉三鹰,批号:SA00001-1)。病理切片机(德国Leica,型号:RM 2016);(流式细胞仪Beckman,型号:CytExpert);实时荧光定量PCR仪(ABI,型号:QuantStudio 12K);PCR仪(LongGene,型号:A300);水平电泳仪(JUNYI Electrophoresis Co,型号:JY300);紫外分析仪(JUNYI Electrophoresis Co,型号:JY02S);凝胶成像系统(Bio-rad,型号:ChemiDocTMXRS+)。

1.3 造模、分组及给药

SD大鼠按照SPF级标准适应性喂养7天后,根据随机数字表选取30只大鼠为模型制备组,剩余12只为正常组,模型制备组自由饮用5% DSS溶液[11-12],正常组自由饮用纯净水,连续7 天后,正常组和模型制备组各随机抽取3只大鼠,对照两组大鼠一般情况、结肠组织形态改变及病理结构改变确定造模是否成功[13]。造模成功后模型制备组27只大鼠根据随机数字表分为模型组、美沙拉嗪组、复方芩柏颗粒组三组,每组9只大鼠。

正常组及模型组:灌服生理盐水,2 mL/次,2次/天,连续3周方式干预;美沙拉嗪组:美沙拉嗪在成人溃疡性结肠炎急性活动期服用剂量为3 g/d,参照《动物实验方法学》一书[14],可得大鼠等效剂量为270 mg/(kg·d)。将美沙拉嗪肠溶片用蒸馏水溶解配置成500 mg/mL母液,按照灌胃浓度用蒸馏水稀释成15.5 mg/mL,使用时按照灌服,2次/d,2 mL/次,连续3周方式干预;复方芩柏颗粒组:前期实验已得出最佳复方芩柏颗粒大鼠给药浓度为2.52 g/(kg·d)[9],将复方芩柏颗粒用蒸馏水溶解配置成1g/mL母液,按照灌胃浓度用蒸馏水稀释为145 mg/mL,使用时按照灌服,2次/d,2 mL/次,连续3周方式干预。干预结束后处死大鼠。

1.4 标本采集

将大鼠固定于无菌操作台上,用3%戊巴比妥腹腔注射深度麻醉大鼠后,打开大鼠胸腔,暴露心脏,针头刺入右心室采血,离心后将血清保存在-80℃环境下,以待后续检测。颈椎脱臼法处死大鼠,打开大鼠腹腔,采集大鼠肠系膜淋巴结及脾脏用于后续单细胞悬液制作。离断大鼠耻骨联合,分离肛管,取出肠道,于回盲部分离,纵轴剖开,祛除残余粪便,观察大鼠肠道情况,病变明显处留取标本,保存在-80℃环境下以待后续检测。

1.5 大鼠一般情况观察

自造模第一日起,每日密切观察并记录各组大鼠饮食、饮水、粪便及大便隐血、活动、体质量等一般情况。根据疾病活动指数(disease activity index,DAI)评估大鼠溃疡性结肠炎严重程度,DAI 评分=(体质量下降分数+大便性状分数+便血分数)/3。DAI 评分法见表1。

表1 DAI评分标准

1.6 大鼠结肠组织病理变化观察

大鼠结肠组织放置于4%多聚甲醛溶液中固定24小时后石蜡包埋切片,脱蜡水化后进行苏木素—伊红(hemotoxylin-eosin staining,HE)染色,于显微镜下观察结肠组织病理学变化,记录并拍照。

1.7 流式细胞仪检测大鼠脾脏、肠系膜淋巴结中Th1/Th2、Th17/Treg细胞比例

取大鼠肠系膜淋巴结及脾脏细胞,研磨过滤后制作单细胞悬液,重悬并调整细胞浓度为1×106个/mL。取100 μL上述单细胞悬液按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原(CD4+、CD25+),4 ℃孵育30分钟,加入预冷后的流式染色缓冲溶液洗涤细胞,离心5分钟(1000 r/min),加入1 mL的固定/破膜工作液(1∶3稀释),混匀,4 ℃避光孵育45分钟,再加入2 mL破膜缓冲液(1∶9去离子水稀释)离心洗涤细胞后弃上清,加入FoxP3(或IL-4、IL-17A、IFN-γ)抗体,避光4℃孵育30分钟后加入1 mL破膜工作液离心洗涤细胞2次并弃上清,最后加入0.5 mL PBS重悬细胞,上机检测。

分别检测各组大鼠脾脏、肠系膜淋巴结中CD4+IFN-γ+细胞、CD4+IL-4+T细胞、CD4+IL-17A+T细胞、CD4+CD25+FoxP3+T细胞占CD4+T细胞百分比,以观察治疗前后Th1、Th2、Th17、Treg细胞百分比含量。

1.8 RT-PCR 法检测结肠组织中T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3 的mRNA表达

Trizol法提取总RNA后进行基因组DNA去除反应,用逆转录试剂盒将组织RNA逆转录为cDNA,引物设计如表2。

表2 T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3引物序列

再置于PCR仪上扩增检测,反应条件为95℃预变性1分钟;95℃10秒,60℃10秒,72℃10～15秒,循环40次。获得运行数据,最终数据以2-△△Ct法进行分析并整理。

1.9 Western blot 法检测结肠组织中RORγt、FoxP3的蛋白表达

样品制备:大鼠肠道组织冰上研磨后加入裂解液冰上裂解20分钟,离心后取上清用BCA试剂盒检测总蛋白含量,加入适量5×上样缓冲液,混匀后煮5分钟。后进行SDS-PAGE电泳:固定电泳装置,加Tris-甘氨酸电泳缓冲液,加样品和预染Marker。连接电源(电压80V),待溴酚蓝至分离胶时电压改120V,直到溴酚蓝至分离胶底部,关闭电源。 Western blot 检测:转膜、封闭、洗涤后将一抗和靶蛋白结合,洗涤后温育二抗和一抗,洗涤后将ECL 试剂滴加在封口膜上。将PVDF膜的正面朝下接触发光试剂,显色2分钟,翻转PVDF膜,观察结果。

1.10统计学处理

2 结果

2.1 对大鼠一般情况及肠黏膜影响

正常组大鼠食欲旺盛,饮水正常,体质量未见明显下降,反应敏捷,粪便色黑,麦粒状,粪便隐血(-)。肠壁无增厚,黏膜完整,绒毛排列整齐,未见脱落、溃疡、隆起、坏死;模型组大鼠体质量下降,易惊恐,饮食饮水减少,出现行动迟缓、大便稀溏、大便隐血阳性等症状。其结肠长度变短,肠壁水肿,肠黏膜面充血,有弥漫性出血点、糜烂和溃疡,隐窝脓肿;美沙拉嗪组及复方芩柏颗粒组大鼠症状较模型组改善, 饮食、 饮水量、 体质量趋向正常组,结肠长度较正常组稍短,肠黏膜及肠壁形态及结构较模型组恢复,充血水肿、溃疡病变处减少。四组大鼠DAI评分总体均数不等(H=30.051,P=0.000),如表3所示。

表3 各组大鼠DAI评分

2.2 对大鼠结肠病理形态改变影响

正常组大鼠结肠组织黏膜完整连续、腺体排列整齐规则,结构清楚,未见明显炎性细胞浸润;模型组大鼠结肠组织可见黏膜下层充血、水肿,毛细血管扩张,黏膜及黏膜下层有炎性细胞浸润,腺体破坏严重,肌层变薄。美沙拉嗪组及复方芩柏颗粒组大鼠治疗后其结肠组织病理形态改变相似,均为黏膜及黏膜下层存在少量充血和水肿现象,肌层较正常组略微变薄,炎性细胞浸润较模型组减少。见图1。

注: A 正常组;B 模型组;C 美沙拉嗪组;D 复方芩柏颗粒组。

2.3 对大鼠Th1/Th2、Th17/Treg细胞比例影响

与正常组相比,模型组Th1细胞含量显著升高(P<0.05)。美沙拉嗪组及复方芩柏颗粒组干预后Th1细胞含量较模型组降低(P<0.05);模型组Th2细胞含量较正常组显著降低(P<0.05)。美沙拉嗪组及复方芩柏颗粒组干预后Th2细胞含量较模型组明显升高(P<0.05);模型组Th17细胞含量较正常组显著升高(P<0.05)。美沙拉嗪组及复方芩柏颗粒组干预后Th17细胞含量较模型组降低(P<0.05);模型组Treg细胞含量较正常组明显降低(P<0.05)。复方芩柏颗粒组、美沙拉嗪组干预后Treg细胞含量较模型组降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠Th1、Th2、Th17、Treg细胞百分比

由于模型组Th1、Th17细胞比例较正常组上升,Th2、Treg细胞比例较正常组下降,故模型组中Th1/Th2、Th17/Treg细胞比值较正常组升高;与模型组相比,美沙拉嗪组及复方芩柏颗粒组Th1、Th17细胞比例回调下降,Th2、Treg细胞比例回升,故美沙拉嗪组及复方芩柏颗粒组Th1/Th2、Th17/Treg细胞比值较模型组下降。其中复方芩柏颗粒组Th1/Th2细胞比值下调较美沙拉嗪组更明显。

2.4 对大鼠T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3的 mRNA 表达影响

通过 RT-PCR 检测大鼠结肠组织中转录因子T-box转录因子(T-box expressed in T cells,T-bet)、GATA结合蛋白3(GATA binding protein-3,GATA-3)、维甲酸相关孤儿受体γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt,RORγt) 及FoxP3 的 mRNA 表达水平。模型组中T-bet 、RORγt的mRNA含量高于正常组(P<0.05),模型组GATA-3、FoxP3的mRNA含量低于正常组(P<0.05)。与模型组相比,美沙拉嗪组及复方芩柏颗粒组治疗后T-bet、RORγt的mRNA含量降低(P<0.05),GATA-3、FoxP3的mRNA含量升高(P<0.05)。各组T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3的 mRNA 表达见表5。

表5 各组大鼠T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3的 mRNA 表达

2.5 对大鼠RORγt、FoxP3 的蛋白表达影响

通过Western blot检测大鼠结肠组织中RORγt、FoxP3的蛋白表达。与正常组相比,模型组RORγt 蛋白表达升高(P<0.05),FoxP3蛋白表达降低(P<0.05)。与模型组相比,美沙拉嗪组及复方芩柏颗粒组治疗后RORγt 蛋白表达降低(P<0.05),美沙拉嗪组及复方芩柏颗粒组治疗后FoxP3蛋白表达升高(P<0.05)。复方芩柏颗粒组RORγt的蛋白表达较美沙拉嗪组下调更为明显(P<0.05)。见表6、图2。

注:NC正常组; UC模型组; QB复方芩柏颗粒组; ME美沙拉嗪组。

表6 各组大鼠RORγt、FoxP3的蛋白表达

3 讨论

目前研究认为,UC的发病机制中免疫功能失衡是重要因素之一,T淋巴细胞在炎症刺激下可激活 CD8+T 细胞,进一步激活CD4+T 细胞,二者之间的平衡反映T细胞功能。CD4+T 细胞可分为Th 细胞和Treg细胞,Th 细胞又可分为Th1、Th2、Th9及 Th17等细胞亚群。

3.1 Th1/Th2免疫平衡及相关细胞因子

Th1和Th2细胞由Th0细胞分化而成。Th1细胞主要产生IFN-γ、IL-2等促炎因子,对抗细胞内病原体导致的免疫反映。转录因子T-bet是Th1细胞的特异性转录因子,IL-2可通过诱导T-bet表达增加Th1细胞分化。T-bet在产生IFN-γ过程中起决定性作用,IFN-γ又可诱导T-bet表达,二者之间形成正反馈调节环[15]。T-bet亦可转导进入Th2细胞中,抑制IL-4等抑炎因子表达及Th2细胞分化;Th2细胞主要产生IL-4、IL-5和IL-13等抑炎因子对抗寄生虫及过敏反应。GATA-3是Th2细胞的特异性转录因子,IL-4依靠GATA-3促使Th0细胞分化为Th2细胞[16]。正常情况下,Th1和Th2细胞保持动态平衡,联合其他的因素共同调节机体免疫平衡[17]。而在UC急性活动早期外周血中IFN-γ等Th1细胞分泌的促炎细胞因子含量明显升高,抑炎因子相对不足导致炎症发生;后期外周血中IL-4、IL-6等Th2细胞分泌的抑炎细胞因子水平明显降低导致炎症反应剧烈,即Th1/Th2细胞平衡被打破致使免疫失常从而诱发炎症[18]。

3.2 Th17/Treg免疫平衡及相关细胞因子

Th17/Treg细胞稳态失衡是 UC 发病的另一重要机制。二者相互抑制互相拮抗,亦可相互转化[19-21]。Th17细胞可防御细胞外细菌感染,也介导自身免疫性疾病和慢性炎症。主要分泌IL-17、IL-21、IL-23等促炎细胞因子,可促使多种细胞分泌趋化因子和细胞因子,并通过细胞集落刺激因子和趋化因子促进中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞增殖和成熟。RORγt是Th17细胞的特异性细胞转录因子。RORγt表达可抑制Treg细胞分化,促使TGF-β、IL-6、IL-23等多种促炎因子共同调控Th17细胞分化,研究发现去除TGF-β基因可抑制Th17细胞分化,IL-23降低亦可使Th17细胞分化减少[22];Treg细胞通过分泌IL-10、TGF-β等抑炎细胞因子抑制树突细胞、B细胞等细胞活化和增殖来介导免疫耐受。FoxP3是Treg细胞的特异性转录因子,可抑制Th1细胞、Th17细胞等促炎淋巴细胞分化[23]。IL-10维持FoxP3表达同时诱导Treg细胞分化,TGF-β在多种细胞因子调控下亦可诱导Treg细胞分化。由于TGF-β既能诱导RORγt表达又能诱导FoxP3表达,而二者分别是Th17细胞和Treg细胞分化的重要条件,故Th17细胞和Treg细胞在分化过程中是相互拮抗的。

正常情况下,Th17/Treg细胞处于动态平衡状态,共同维持机体肠黏膜免疫稳态,其平衡失常则引发免疫失衡导致炎症反应[24]。UC患者外周血中Th17细胞分泌的IL-17等促炎因子增多,Treg细胞分泌的 IL-10等抑炎因子减少,引起免疫紊乱,导致UC发生[25-28]。

3.3 复方芩柏颗粒对UC的治疗作用

本实验中,模型组大鼠DAI评分明显高于正常组,美沙拉嗪组、复方芩柏颗粒组大鼠经干预后DAI评分下降(P<0.05)。模型组大鼠IFN-γ、IL-17促炎因子含量升高,IL-4抑炎因子、FoxP3细胞因子含量降低(P<0.05),即Th1/Th2、Th17/Treg较正常组显著升高(P<0.05),经美沙拉嗪、复方芩柏颗粒干预治疗后IFN-γ、IL-17促炎因子含量降低,IL-4抑炎因子、FoxP3含量升高(P<0.05),即Th1/Th2、Th17/Treg细胞比值较模型组下降(P<0.05)。提示复方芩柏颗粒可能通过下调IFN-γ、IL-17促炎因子百分比含量、上调IL-4抑炎因子百分比含量、FoxP3水平,恢复Th1/Th2、Th17/Treg细胞动态平衡达到治疗UC效果。

模型组大鼠结肠组织T-bet及RORγt mRNA表达、RORγt的蛋白表达水平显著增高(P<0.05),而GATA-3及FoxP3的mRNA表达、FoxP3的蛋白表达水平明显降低(P<0.05),经美沙拉嗪及复方芩柏颗粒干预治疗后,T-bet及RORγt的 mRNA表达、RORγt的蛋白表达水平均下降(P<0.05);GATA-3及FoxP3的mRNA表达、FoxP3的蛋白表达水平均上升(P<0.05)。提示复方芩柏颗粒可通过上调GATA-3及FoxP3转录因子水平、下调T-bet及RORγt转录因子水平达到治疗UC效果。其机制可能是通过上调GATA-3水平促进Th2细胞分化,上调FoxP3水平促进Treg细胞分化,以抑制免疫应答;下调T-bet、RORγt水平减少促进炎症反应的Th1细胞及Th17细胞增殖分化以控制肠道炎症反应修复肠道黏膜。

综上所述,本实验通过检测复方芩柏颗粒对DSS诱导的UC大鼠转录因子T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3表达及检测Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞治疗前后稳态变化,得出结论:复方芩柏颗粒通过下调T-bet转录因子抑制Th1细胞分化,减少IFN-γ等促炎因子分泌。通过上调GATA-3转录因子增加Th2细胞分化,以此增加IL-4等抑炎因子分泌,从而调节Th1/Th2细胞稳态平衡,减轻肠道炎症反应;同时,复方芩柏颗粒可以下调RORγt转录因子水平、上调FoxP3转录因子水平,抑制Th17细胞分化、促进Treg细胞分化,减少IL-17等促炎因子分泌,以此调节Th17/Treg细胞平衡,减轻炎症反应,增强免疫抑制,达到治疗UC、恢复肠道稳态的效果。