高虫草素含量蛹虫草菌的复合诱变选育研究

李广 张锋

蛹虫草菌是冬虫夏草的近缘种，简称蛹草，不仅含有种类齐全、含量比例适宜的人体必需氨基酸，还含有大量腺苷、虫草素、腺嘌呤，是食药两用的虫草属真菌。其中，虫草素具有抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤、抗癌等功效，是蛹草中重要的活性成分。不同蛹草菌产虫草素能力不同，本文采用LiCl、60Co γ复合诱变，对1株蛹草菌原始菌株进行诱变，考察了LiCl不同质量浓度、60Co γ射线不同辐照剂量对诱变菌株致死率、突变率的影响，并用高效液相色谱法对筛选出的稳定突变体发酵液中的虫草素含量进行测定，筛选出高产虫草素突变体1株，虫草素含量达2.64mg/mL，为蛹虫草菌的进一步改良提供了一定的参考依据。

一、材料与设备

1.材料与试剂。蛹虫草菌（CM#1）；甲基纤维素；磷酸盐缓冲液PBS（pH=7.2）；虫草素标准品；LiCl；亚甲蓝溶液（0.1%）；甲醇；超滤离心管；96孔深孔板；基础培养基；半固体培养基（g/L，基础培养基添加23g甲基纤维素制成）。

2.仪器与设备。液相色谱仪、显微镜、电子天平、生化培养箱、冷冻离心机、1mL移液枪、超纯水机等。

二、实验与方法

1.孢子悬浮液的制备。取保存蛹虫草菌的试管进行孢子悬浮液的制备。用无菌磷酸盐缓冲液PBS（pH=7.2）洗脱、无菌脱脂棉过滤，最后用PBS稀释至1×106conidia/mL。通过亚甲蓝染色显微镜观察确定活孢子，光学显微镜和血球计数板计数法进行统计。

2. LiCl诱变。配制氯化锂PBS溶液并高压灭菌，按照质量体积浓度为0.0%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%加到孢子悬浮液中混合均匀，转移到盛装于三角瓶的20mL半固体培养基中，摇匀。在25℃、无光照条件下静置培养3d，观察统计单菌落并计算致死率。

随机选取出发菌株及LiCl各诱变条件下的8个单菌落，无菌条件下用1mL移液枪转移到96深孔板中的1.6mL液体培养基中，在25℃、无光照条件下静置培养10d。将直径为6mm的无菌滤纸分别浸润各菌落发酵液后置于涂布枯草芽孢杆菌的营养琼脂（NA）平板上，在30℃、无光照条件下培养12h进行抑菌实验测定突变率。通过比较各突变体与出发菌株的抑制直径筛选突变体，抑制直径大于出发菌株抑制直径20%的为正向突变，以正向突变率为指标筛选LiCl最佳质量浓度。

致死率/%=（Nb-Na）/ Nb×100；正向突变率Pf/%=Np/Nv×100。Nb、Na分别为诱变前、后菌落数，Np、Nv分别为正向突变、存活菌落数。

3.60Co γ射线辐照诱变。以优化质量浓度的LiCl诱变蛹草孢子悬液6h后，分别以0、5、10、20、40、60、80、100、120、140Gy的60Co γ辐照20min，进行致死率实验；参照LiCl诱变中的方法，以枯草芽孢杆菌抑菌实验测定正向突变率，选择最佳辐照剂量。以确定的正向突变率为指标筛选突变株，分别接种到PDA斜面培养基，于25℃、无光照条件下连续6次传代，每代6d。将1代和6代突变体株接种到含有20mL液体培养基的50mL离心管中，在无光照、25℃恒温条件下静置培养30d。采用高效液相色谱法，通过比较相同突变株的1代和6代菌株发酵液虫草素含量，筛选获得5个稳定突变体。

4.虫草素含量的测定。筛选出的5个稳定突变体及出发菌株于避光、25℃恒温条件下静置培养30d，发酵液经10000r/min高速离心5min，过0.22μm滤膜后进HPLC测定各发酵液中虫草素含量。色谱条件如下：色谱柱：Diamonsil C18（4.6μm×250mm，5μm）；流动相A：水；流动相B：甲醇；梯度洗脫：0 min，85%A→11.5min，20%A→11.6min，20%A→16.1min；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；进样体积：20?L；检测波长：261nm。

三、结果与分析

1.LiCl质量浓度的选择。不同质量浓度LiCl的诱变结果见表1。随着诱变剂LiCl质量浓度的增加，蛹草菌的死亡率逐渐增大，当浓度为0.30%、0.35%时致死率达94%以上，浓度为0.40%时致死率达到100%，基本上没有菌体存活。当LiCl的质量浓度为0.20%时，致死率为76%，正向突变率最大为28%，与文献所述此时菌体发生正向突变的概率最大相符。最终确定LiCl最佳诱变质量浓度为0.20%。

2.60Co γ射线辐照剂量的选择。表2为经质量浓度0.20%的LiCl诱变，不同剂量60Co γ射线辐照后的致死率和突变率数据。由表2数据可知，随着暴露剂量的加大，致死率逐渐增大，正向突变率先增大后降低。当辐照剂量为140Gy时，基本没有孢子存活。辐照剂量为80Gy时，致死率为78%，正向突变率最大为38%，确定最佳辐照剂量为80Gy。

3.液相色谱条件的选择优化。（1）流动相洗脱条件的优化。因本实验在研究蛹草中虫草素含量变化时还会涉及腺嘌呤指标，虽然参照《虫草制品中虫草素和腺苷的测定 高效液相色谱法》（NY/T 2116-2012）能较好地分离检测虫草素，但腺嘌呤却得不到较好的分离，不能准确测定其含量。通过尝试更换流动相中有机试剂种类并逐步调整流动相比例，最终确定流动相条件为：A水、B甲醇，梯度洗脱，此时，腺嘌呤和虫草素均能得到较好的分离，见图1。

（2）检测波长的选择。对虫草素、腺嘌呤进行紫外波长扫描，发现在209nm、261nm处两种化合物均有较大吸收，且209nm处的吸收值要大于261nm处吸光值，但考虑到发酵液基质较复杂，低波长209nm处很多化合物都会有吸收，会对目标物的分离检测带来干扰，所以选择261nm为最佳检测波长。

4.HPLC法复筛高产虫草素突变株。将筛选出的5个稳定突变体CMp1-CMp5及原始菌株CM#1在基础培养基中接种培养30d，用HPLC法测定发酵液中虫草素含量，进行高产虫草素突变体筛选，结果见表3。由表3可知，原始菌株发酵液中虫草素含量为1.26mg/mL，正向突变菌株发酵液除1个突变体含量较低（0.624mg/mL）外，其他菌株发酵液中虫草素含量均在1.65mg/mL以上，最高达2.64mg/mL，是原始菌株的2倍多。

四、结论

本实验以致死率、突变率为指标，考察了诱变剂LiCl不同质量浓度、60Co γ射线不同辐照剂量对蛹虫草菌原始菌株的诱变影响，最终筛选出高产虫草素突变体1株，发酵液中的虫草素含量达到2.64mg/mL，实现了蛹草菌株的改良，为后续选育更高产虫草素菌株提供了重要技术和数据参考。

基金项目：甘肃省属科研院所创新能力建设专项（21JR7RA765）。

作者简介：李广（1981-），男，汉族，山东肥城人，助理研究员，硕士研究生，研究方向为食品安全、生物次生代谢产物。

*通信作者：张锋（1981-），男，汉族，高级工程师，大学本科，研究方向为食品安全。