脂肪酶产酸特性对UHT牛奶质量的影响研究

赵美霞 巴根纳 樊启程 贺保平 杨红彦 高瑞雄

UHT灭菌乳是将生鲜牛奶经预热、均质，在连续流动的情况下加热到至少132℃以上，保持4-6s杀菌，最后进行无菌灌装。这是不需要冷链储藏、运输的常温液态奶产品，保质期在常温状态下可以达到6-9个月。

牛奶中的酸度分为固有酸度和外来酸度，固有酸度来源于牛奶本身的酸度，由牛奶中的固有柠檬酸、二氧化碳物质溶于水相中而产生；外来酸度来源于牛奶中的微生物产生，如细菌、霉菌、酵母菌、蜡样芽孢杆菌、嗜冷菌代谢产生的脂肪酶作用于牛奶中的脂肪而产生游离脂肪酸，给牛奶带来外来酸度。脂肪酶产生的脂肪酸会对牛奶产品质量产生较大影响，一方面导致产品酸度升高，当酸度增加到一定程度，pH会随之降低到一定值，使牛奶中的酪蛋白发生酸凝固或酸弱凝胶，牛奶体系发生崩解，导致牛奶质量变劣；另一方面，脂肪酶将牛奶中脂肪甘油酯水解成次级产物，产生酸苦味道，导致牛奶风味变劣。产脂肪酶的常见微生物有三类，包括细菌类、酵母类、真菌类，本文重点研究细菌来源的脂肪酶产酸特性对UHT牛奶质量的影响。

一、材料和设备

1.试剂。纯水、硫酸钴比色试剂、酚酞试剂（5g/mL）、0.1N的NaOH溶液。

2.原料。无水奶油/粉、酵母浸膏、硫酸镁、琼脂。

3.实验器材。高压蒸汽灭菌锅、0.2?m无菌过滤器、无菌瓶、微生物培养箱、超净工作台、千分之一感量天平、牛津杯。

4.脂肪酶样液。脂肪酶标品（来源于酵母菌发酵，6%含量）、含脂肪酶牛奶无菌样液。

二、实验与方法

1.脂肪酶标品对UHT牛奶质量的影响验证。（1）制备0.6%脂肪酶标品无菌液。准确称取6g脂肪酶标品，加入纯净水194g，充分摇匀，制备成0.6%脂肪酶溶液。通过0.2?m除菌滤膜过滤，制成脂肪酶无菌液。

（2）將脂肪酶无菌加入UHT牛奶中的酸度和口感变化情况。在超净环境下，将UHT纯牛奶分装在无菌瓶中，每瓶200mL，按照150ppm、15ppm、12ppm、9ppm、7.5ppm、6ppm、1.8ppm、1.5ppm、0.15ppm梯度浓度，在纯牛奶中接入脂肪酶无菌液。在42℃培养箱中培养4小时-10天，记录牛奶样品酸度变化、口感变化。结果如表1-表4所示。

（3）测定滴定酸度。以牛奶吉尔涅尔酸度表征，滴定方法为通过耗用NaOH溶液的毫升数来表征牛奶中的酸度。UHT灭菌乳中的酸度范围一般为14oT-17oT，当pH处于6.30以下时，滴定酸度会上升至20oT以上。

2.含有脂肪酶的样液产酸判定。基于脂肪酶标品对UHT牛奶质量影响的研究结果，可以得出脂肪酶对牛奶质量产生较大影响的结论。当牛奶可能受到脂肪酶污染时，可以通过脂肪酶产酸判定实验来完成牛奶中含有脂肪酶的定性判定。对标标品酶对牛奶质量的影响结果，可以预判并完成牛奶样品的脂肪酶在货架期后期会对牛奶产生哪些影响。

（1）脂肪酶样液产酸培养实验。将无水奶油/粉、酵母膏、硫酸镁、琼脂、纯水配置成培养基，pH为6.80-7.90，加入1%的中性红显色剂，经过121℃、15min高压灭菌锅灭菌后，在超净台上倒入平皿中。冷却至室温时，将无菌牛津杯放入平皿中，在牛津杯中加入100uL含脂肪酶牛奶无菌液。同时，设置1.5%琼脂+98.5%纯水的琼脂平皿对照样，将平皿放置在42℃培养箱中培养10-24h。

（2）产酸结果判定。观察牛津杯周围培养基是否变为红色，变为红色且空白平皿样未变色判定为阳性，记录为“+”，说明样液中含有脂肪酶，反之则为“-”。实验结果如表5和图1所示，由此可以判定，该脂肪酶样液加入牛津杯后，牛津杯周围培养基出现明显的红色区域，说明脂肪酶样液中的脂肪酶水解了培养基中的无水奶油，产生游离酸，游离酸使得牛津杯附近培养基的pH下降，培养基中的指示剂颜色发生变化。

图1：脂肪酶产酸实验结果

（3）酸度对牛奶质量的影响。脂肪酶的种类和来源不同，对牛奶质量的影响是否与标样脂肪酶一致，需要做比对分析。本研究中的脂肪酶标品为褶皱假丝酵母经生物发酵、富集、纯化工业化制备而成，而脂肪酶无菌牛奶样液为原奶受到细菌污染而产生的脂肪酶经提取工艺富集、制备而成。两者虽然同为脂肪酶，但是来源完成不同，对牛奶质量的影响是否相同就需要通过实验进行比对分析。

检测脂肪酶样液和脂肪酶标品的脂肪酶活力时，采用脂肪酶活性试剂盒微量法。检测试剂中的4-硝基苯棕榈酸酯在脂肪酶作用下产生4-硝基苯酚，在400nm处检测吸收值，计算出酶活力（U/mL）。以UHT牛奶中可允许的牛奶脂肪酶无菌样液添加量为上限值，设定梯度，将无菌样液回填至UHT牛奶中，考察无菌样液对牛奶质量的影响。结果如表6所示。

由此可以看出，牛奶中提取到的脂肪酶按照不同添加量回填至牛奶中，随着货架期的延后，都表现出了酸度不断提升、口感差异的现象。添加量越大的样品，其酸度上升的时间越早，持续上升程度越大。但是添加量最低的样品风味变化呈正相关，牛奶的香味逐渐增强。

3.脂肪酶差异分析。对比发现，微生物发酵来源的脂肪酶和牛奶中来源的脂肪酶对牛奶质量表现出了相同的影响规律，即将脂肪三甘油酯水解成游离脂肪酸，导致牛奶酸度和风味发生变化。但是二者在分子微观结构上是否存在差异需要进一步分析，这对牛奶中脂肪酶的提取工艺、去除工艺都具有理论指导意义。

采用凝胶色谱分析（GPC）的方法，对两种酶进行上柱检测，流出曲线结果如图2、图3所示。分析峰面积分布情况可以看出，微生物发酵的脂肪酶相对分子量较大（1-1187KMn），而牛奶中提取的脂肪酶相对分子量较小（1-841KMn），因此，制备、分离这两种酶的超滤膜孔径在选择上就大不相同。由此可见，在微观分子角度，这两种酶差异明显。

综上所述，脂肪酶会对牛奶质量产生较大影响，持续产酸的特性会直接导致牛奶品质变劣，对企业造成不可逆转的经济损失，所以是牛奶生产加工过程中要重点管控的一项内容。不同来源的脂肪酶相对分子量不同，依据分子量分布，企业应该选取合适的分离膜孔径，以分离、去除脂肪酶。