西澳菲斯特农场赤桉树蜂蜜对血虚证模型小鼠的影响

赵立波 陈家铃 陶春霖

再生障碍性贫血（Aplastic amemia，AA），又称血虚证，为中医临床常见症候，是一种以造血功能衰竭为特征的疾病，其发病机制主要与骨髓造血干细胞损伤、造血微环境损伤以及免疫性造血抑制等机制相关。目前，治疗AA的主要药物如环孢素（cyclosporine A，CsA），存在使用后反应率较低且复发率较高的缺点。本研究以西澳菲斯特农场赤桉树蜂蜜为研究对象，通过建立小鼠血虚模型，探究服用不同剂量的TA10+FFJH以及TA30+FFJH对小鼠血虚症状的影响。

一、实验材料

1.实验药品与试剂。西澳菲斯特农场赤桉树蜂蜜（Fewsters Farm jarrah honey，FFJH），洋妆源（上海）网络科技有限公司；乙酰苯肼、淋巴细胞分离液，美国SIGMA公司；环磷酰胺，上海华联制药有限公司；促红细胞生成素（EPO）ELASA试剂盒，美国R&D Systems公司；其他试剂均为国产分析纯或生化试剂。

2.实验动物。选择BALB/c小鼠80只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。雌雄各半，年龄为8-12周，体重控制在18-22g。饲养温度为（23±1）℃，湿度控制在40%-60%，24h光暗循环，通风良好。饲养期间保证小鼠自由饮水、饮食。

二、实验方法

1.模型建立。（1）实验分组。选取BALB/c小鼠80只，在适应性喂养1周后，将其分为以下8组：①正常对照组；②血虚模型组；③25%-TA10+FFJH组；④50%-TA10+FFJH组；⑤75%-TA10+FFJH组；⑥25%-TA30+FFJH组；⑦50%-TA30+FFJH组；⑧75%-TA30+FFJH组。每组小鼠各10只。（2）实验流程。按照乙酰苯肼、X射线、环磷酰胺联合应用的方法，建立再生障碍性贫血小鼠模型。将不同剂量的蜂蜜溶解至等量生理盐水中，从第7d开始，以每天1次的频率按各组劑量对小鼠进行灌胃，同时对空白对照组以及血虚模型组的小鼠灌胃等体积的生理盐水。实验周期为45d，45d后颈椎脱臼处死小鼠，采样进行检测。

2.各组小鼠一般行为学观察。经上述步骤处理45d后，对小鼠的运动灵活度、反应敏捷度、毛发光泽度、脱毛情况及体重变化情况进行观察统计。

3.外周血检测。（1）细胞计数。各实验组在第45d对各组小鼠进行称重，经眼眶取血，测定外周血的血红蛋白含量、红细胞、白细胞及血小板数；在显微镜下观察外周血涂片，并进行细胞计数。（2）EPO浓度测定。EPO是一种重要的造血调控因子，血液中的EPO水平能够反映机体生成红细胞的能力。参考文献中的方法，对血液进行样品处理，使用试剂盒对血液中的EPO含量进行测定，根据标准曲线计算得出样本的EPO浓度（pg/mL）。

4.骨髓有核细胞（BMCs）计数。实验参考陈姗姗等的方法，颈椎脱臼处死小鼠，取右侧股骨，用PBS缓冲液反复冲洗，取骨髓细胞悬液，配平至相同体积，取0.2mL细胞悬液裂解红细胞后，以自动细胞计数仪计数BMCs数量。

5.统计学分析。实验数据至少重复3次，结果以Means±SEM表示。采用Origin8.5和SPSS分析软件对实验数据进行处理分析，统计结果P＜0.05认为有显著性差异。

三、结果分析

1.血虚模型小鼠一般行为学观察。与正常对照组相比，血虚模型组小鼠陆续出现皮毛蓬乱、光泽度降低以及部分脱毛现象，且随着实验进程的发展，症状逐渐加重。同时，小鼠还出现精神不佳、活动减少、体重下降的症状。

对比服用各FFJH剂量组与血虚模型组发现，服用FFJH组小鼠的皮毛光泽度下降及脱毛的程度均有所减轻，精神状态也有明显提升。各组小鼠的体重平均值如图1所示，通过对比可以看出，灌胃FFJH各组小鼠的平均体重均高于血虚模型组，且呈剂量对应关系，说明FFJH对血虚引起的小鼠体重下降有抑制作用。同时，通过在同剂量添加下体重值的对比可以观察到，TA30+FFJH较TA10+FFJH的效果更佳。

图1：FFJH对小鼠体重的影响（）

注：与空白组相比，#代表与空白对照组相比差异显著，P＜0.05；*表示与模型组相比差异显著。

2.FFJH对血虚模型小鼠外周血三系水平的影响。表1为不同FFJH剂量组、空白对照组以及血虚模型组小鼠的外周血中血红蛋白（Hb）、红细胞（RBC）、白细胞（WBC）以及血小板（PLT）水平情况。由表1可以看出，在血虚模型条件下，小鼠血常规中的各项指标均显著降低（P＜0.01），即血虚模型组小鼠的血象三系水平明显下降。服用各FFJH剂量组与血虚模型组相比，小鼠的外周血三系水平均有所提升，且呈剂量对应关系，说明FFJH对小鼠的再生障碍性贫血有显著改善效果（P＜0.01）。

3.FFJH对血虚模型小鼠EPO浓度的影响测定。研究表明，EPO具有抗凋亡以及促进血管生成的作用，其浓度水平能直观反映骨髓红系造血功能障碍的程度，图2为不同FFJH剂量组、空白对照组以及血虚模型组小鼠的EPO浓度测定结果。在血虚模型条件下，小鼠血清中的EPO浓度显著提高（P＜0.01），而各FFJH剂量组与血虚模型组相比，EPO含量均显著降低，并呈剂量对应关系（P＜0.01）。实验结果说明，FFJH对再生障碍性贫血小鼠外周血中各种血细胞的形成有促进作用，而且通过组间数据对比发现，在同剂量添加条件下，TA30+FFJH组较TA10+FFJH组的EPO浓度下降更明显，说明TA30+FFJH降低EPO浓度的作用比TA10+FFJH更好。

图2：FFJH对小鼠血液中EPO水平的影响（）

注：与空白组比较，##代表与空白对照组相比差异极显著，P＜0.01；**表示与模型组相比差异极显著，P＜0.01。

4.FFJH对小鼠BMCs水平的影响。图3为不同FFJH剂量组、空白对照组以及血虚模型组的BMCs水平。与空白组相比，血虚模型组小鼠的造血干细胞数量显著下降（P＜0.01），而各FFJH剂量组的BMCs水平明显高于血虚模型组，并呈剂量对应关系（P＜0.05），推测FFJH有促进造血干细胞增殖的效果，可以抑制再生障碍性贫血小鼠有核细胞减少，进而对骨髓的造血机能产生明显的促进作用。通过组间数据对比可以发现，在同剂量添加条件下，TA30+FFJH组较TA10+FFJH组促进造血干细胞增殖的效果更明显，说明TA30+FFJH促进造血干细胞增殖的作用比TA10+FFJH更好。

图3：FFJH对小鼠BMCs水平的影响（）

注：与空白组相比，##代表与空白对照组相比差异极显著，P＜0.01；**表示与模型组相比差异极显著，P＜0.01。

综上所述，本实验通过建立小鼠血虚模型，观察各组小鼠体重变化、外周血常规、EPO浓度以及骨髓单个核细胞数的差异，发现FFJH可以改善血虚模型小鼠再生障碍性贫血导致的精神不佳、毛发光泽受损、体重下降症状。服用FFJH后，模型小鼠血象三系水平以及骨髓细胞水平的下降速度均明显减缓（P＜0.01），EPO水平波动明显减小，并呈剂量对应关系（P＜0.01），说明FFJH能有效缓解并修复血虚模型处理小鼠的骨髓造血微环境受损。不过，本研究也存在一定的不足之处，虽然证明了FFJH可以为机体补充相关营养素以减轻小鼠的血虚症状，但未对调节血虚症状的具体机制进行进一步研究。

作者简介：赵立波（1987-），男，汉族，河南信阳人，工程师，硕士研究生，研究方向为功能性食品。

陈家铃（1993-），女，汉族，贵州安顺人，大学本科，研究方向为原料包裹及改性。

*通信作者：陶春霖（1986-），男，汉族，天津人，大学本科，研究方向为原料包裹及改性。