竹盐对便秘小鼠的影响及其机制研究

肖敏，刘达，游秋云，但汉雄，尤朋涛

1.湖北中医药大学药学院，中药资源与中药化学省级重点实验室（武汉 430065）；2.武汉绿时代创新科技有限公司（武汉 430012）

便秘是一种常见的胃肠功能性疾病，慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）是便秘中最常见的类型[1]。便秘主要临床表现是大便次数减少、粪便干硬、排便困难。它在各个年龄段人群中普遍存在，在老年人和女性中发病率越来越高，其病情会反复发作，难以治愈，严重影响了患者的生活质量[2]。STC现有治疗药物主要有缓泻剂如开塞露和促动力剂如枸橼酸莫沙必利，药物治疗便秘虽然短期内疗效较好，但是长期使用会引起药物依赖、胃肠动力不足等多种不良反应[3]。因此，寻找安全有效的天然活性物质在治疗和缓解慢传输型便秘具有重要的意义。

竹盐是原盐经特殊加工得到的保健食用盐。将原盐放进竹筒封上黄泥，在特制的窑中进行煅烤，反复经过升温、保温、再升温、再保温等过程，可得到一烤竹盐至八烤竹盐，如果想要得到纯度较高的九烤竹盐，需要将炉温升到1 300 ℃让盐粉熔化成液态，气化蒸发掉其中的重金属氯化物，并清理出其他杂质的悬浮物和深沉物[4]。冯霞等[5]检测发现竹盐的钙、镁、铁、锰、磷、硫、钾含量均高于海盐。因此，竹盐比一般食盐也就多了更多的养生与保健的功效。竹盐具有弱碱性，可以中和机体内酸性代谢产物，被誉为“自然界解毒之王”和“药用盐”。现已有研究结果表明，竹盐具有潜在的抗癌作用[6]、抗炎作用[7]、抗皮肤衰老作用[8]、增强免疫作用[9]等，并提示竹盐有助于缓解消化系统疾病[10]。Huang等[11]发现竹盐含有的成分之一硫化氢，外源应用硫化氢在生理相关浓度下可以促进体外成熟胃起搏细胞Cajal间质细胞（interstitial cells of cajal，ICC）的增殖。ICC的增殖和存活与c-kit原癌基因（c-kit proto-oncogene protein，c-kit）和配体干细胞因子（stem cell factor，SCF）结合后激活信号通路有关[12]。Ikarasgi等[13]研究发现导泻剂硫酸镁可导致肠HT-29细胞水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）表达增多，可能的机制是镁离子引起腺苷酸环化酶活化，催化产生环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），引起蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）的活化，导致环磷腺苷效应元件结合蛋白磷酸化，促进了AQP3的表达。周永学等[14]发现血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）静脉注射能够激活cAMP/PKA通路，促进AQP3的表达，影响便秘大鼠肠道水液代谢，进而改善便秘症状。此研究采用盐酸洛哌丁胺诱导STC小鼠模型，检测血清中胃肠激素、神经递质、结肠中相关蛋白和基因表达水平，观察竹盐对便秘小鼠的影响，并基于SCF/c-kit和VIP/PKA/cAMP/AQP3通路初步探讨其作用机制，以期为开发相关功能性食品提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

60只昆明SPF级小鼠，雌性，体重26～28 g（湖北省疾病预防控制中心），许可证号：SCXK（鄂）2020-0018。动物进入实验室，适应性喂养1周后开始试验。实验室通气良好，室温25±2 ℃，相对湿度50%～70%。

九烤竹盐（湖北省中科盐谷科技有限公司），为粉末状，于4 ℃冰箱备用。枸橼酸莫沙必利片（国药准字J20140149，苏州住友制药有限公司）；c-Kit抗体（批号AF6153）、VIP抗体（批号DF6627）、PKA抗体（批号AF7746）、AQP3抗体（批号AF5222）：江苏亲科生物研究中心有限公司；GAPDH抗体（批号97166T）、二抗兔抗（批号7074P2）：美国Cell Signaling Technology公司；小鼠胃泌素（gastrin，Gas）酶联免疫分析试剂盒（批号A119258-96T）、小鼠P物质（substance-P，SP）酶联免疫分析试剂盒（批号A105714-96T）：上海抚生实业有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）检测试剂盒（批号A012-1）：南京建成生物工程研究所；阿拉伯树胶（批号A108975）、医药级别活性炭（批号A304261）、盐酸洛哌丁胺（批号L129465）：上海阿拉丁集团有限公司；RIPA-PMSF裂解缓冲液（批号P0013B）：上海Beyotime公司。

1.2 仪器与设备

酶标仪（SPARK10M，美国瑞士帝肯有限公司）；万分之一天平（AL-204，美国特勒-托利多仪器有限公司）；qPCR仪（Step One Plus，美国Applied Biosystems公司）；蛋白电泳仪（Power Pac，美国Bio-Rad有限公司）；成像系统（NIKONDS-U3，日本尼康公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 便秘小鼠模型的建立与给药

60只雌鼠，随机分为空白组、模型组、低中高给药组、阳性对照组，每组各10只。适应性喂养7 d后，空白组灌胃等量0.9%氯化钠注射液，其余组给予盐酸洛哌丁胺10 mg/kg造便秘模型，连续7 d后，从第8天开始，灌胃盐酸洛哌丁胺1 h后，给药组灌胃低中高浓度的竹盐（0.5，1.0和1.5 g/kg），空白组和模型组灌胃等量0.9%氯化钠注射液，阳性对照组灌胃枸橼酸莫沙必利片2.5 mg/kg，连续干预7 d。

1.3.2 小鼠6 h排便粒数统计和小肠推进率的测量

第14天给药后分开饲养，统计6 h的排便粒数。禁食不禁水24 h，灌胃0.2 mL的5%活性炭混悬液，灌胃后开始计时，30 min后处死收集小肠，测量长度，幽门至回盲处的距离计为肠管总长度，幽门至炭末汁前端处计为炭末推进长度，计算小肠推进率，按式（1）计算。

1.3.3 神经递质及胃肠激素检测

将小鼠麻醉后眼眶取血，所采血液在低温高速离心机上以3 000 r/min的转速，在4 ℃的条件下离心10 min后收集上清，放入-80 ℃冰箱。使用对应试剂盒检测小鼠血清中胃泌素、P物质、一氧化氮含量，具体步骤参考试剂盒说明书。

1.3.4 便秘小鼠结肠组织的病理观察

剪取小鼠近肛门部位长约2 cm的结肠组织，采用生理盐水冲洗，置10%中性甲醛溶液中固定，常规石蜡切片。苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色后，显微观察结肠组织的病理学变化。

1.3.5 实时荧光定量法（real time quantitative PCR，RT-qPCR）检测小鼠结肠组织中相关mRNA水平

取50 mg各组小鼠的结肠组织，使用预冷的磷酸盐缓冲盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）清洗3次，剪成细碎小块，置于组织匀浆机中，得组织匀浆。RNA-easy裂解液提取RNA。使用紫外分光光度计检测各组RNA浓度，按照反转录试剂盒说明书操作将总RNA反转录合成cDNA。以cDNA为模板对进行PCR扩增，引物序列如表1所示，检测循环数（Ct值），以GAPDH与模型对照组为对照计算ΔΔCt，采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.3.6 蛋白质印迹法检测相关蛋白的表达水平

采用蛋白质印迹法检测。将蛋白酶抑制剂与RIPA裂解液按照体积比1∶100混合均匀，备用。取各60 mg组冻存的结肠组织，加入100 μL裂解液混合物裂解，用眼科剪将组织剪碎，随后用匀浆器对组织碎片匀浆，放置30 min，使其充分裂解。以12 000 r/min离心10 min，取上清液，以BCA法（Bicinchoninic acid，BCA）测定蛋白含量。蛋白经煮沸变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转膜，以5%的牛血清白蛋白封闭液封闭2 h；以Tris缓冲盐溶液加吐温20（Tris Buffered Saline+Tween-20，TBST）洗膜3次，加入VIP、PKA、AQP3、c-kit、GAPDH一抗（稀释度均为1∶1 000），于4 ℃孵育过夜；以TBST洗膜3次，加入二抗（稀释度为1∶1 000），室温孵育2 h；以TBST洗膜3次，加入enhanced chemiluminescence（ECL）显色剂，于化学发光仪上扫描和成像。采用Image J v1.8.0软件对条带灰度值进行分析，以目的蛋白与内参GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

1.4 统计学方法

试验结果采用Graphpad Prism 7.00数据分析软件，采用Studentt-test检验比较组间差异显著性，以P＜0.05作为具有统计学显著性差异的标准。

2 结果与分析

2.1 竹盐对便秘小鼠6 h排便数和小肠推进率的影响

如表2所示，与空白组相比，模型组6 h的排便粒数显著减少，肠推进率显著降低，说明灌胃盐酸洛哌丁胺成功诱导了小鼠的便秘症状。经过竹盐和枸橼酸莫沙必利干预后，6 h的排便粒数显著增加，肠推进率显著升高，说明竹盐和阳性药枸橼酸莫沙必利对盐酸洛哌丁胺诱导的便秘具有一定缓解作用。

表2 竹盐对便秘小鼠6小时排便粒数和小肠推进率的影响（n=8）

2.2 竹盐对便秘小鼠血清中Gas、SP、NO浓度的影响

神经递质可调节胃肠道的运动功能，分为兴奋性神经递质和抑制性神经递质。SP是兴奋性递质，收缩平滑肌，促进胃肠运动[15]；NO是抑制性递质，分泌增多可减慢结肠蠕动，导致便秘[16]。Gas是胃肠激素，可增强结肠平滑肌的收缩，促进结肠运动[17]。研究显示，脾肾阳虚型STC患者血清SP含量降低，NO含量增高[18]；STC大鼠血清中SP和Gas明显减少[19]。如表3所示，试验模型组与空白组比较，血清中Gas、SP浓度明显降低（P＜0.01），NO浓度明显增高（P＜0.01），说明此研究使用盐酸洛哌丁胺诱导成功建立STC小鼠模型。与模型组比较，除了竹盐低剂量组的肠推进率没有明显差异，竹盐中高剂量组和枸橼酸莫沙必利组的肠推进率明显增加（P＜0.01），说明竹盐缓解了盐酸洛哌丁胺诱导的便秘。

表3 竹盐对小鼠肠推进率和血清中Gas、SP、NO的影响（n=8）

2.3 竹盐对便秘小鼠结肠组织形态的影响

如图1所示，经HE染色发现，与空白组相比，模型组结肠黏膜出现紊乱表征，肌层变薄，杯状细胞减少，且有炎性聚集。说明洛哌丁胺诱导的便秘对结肠黏膜组织有一定损害。竹盐低中高剂量组和枸橼酸莫沙必利组结肠组织黏膜排列趋向正常，肌层逐渐变厚，杯状细胞逐渐增多，无炎性聚集。结肠中上述病理学变化在竹盐的干预下出现不同程度改善，说明竹盐缓解了便秘导致的黏膜损伤。

图1 各组小鼠结肠组织形态学的病理变化（×100）

2.4 竹盐对便秘小鼠结肠组织SCF mRNA和c-kit蛋白表达水平的影响

经蛋白免疫印迹分析发现，模型组结肠组织中的c-Kit蛋白表达较空白组明显减少（P＜0.05），经中高剂量的竹盐和阳性药物枸橼酸莫沙必利干预后，c-Kit表达逐渐增加（P＜0.05）。RT-qPCR分析发现模型组肠道组织中SCF的mRNA相对表达量较空白组减少（P＜0.05），经低、中、高剂量竹盐和枸橼酸莫沙必利干预后，便秘模型小鼠肠道组织中SCF mRNA的表达量都有了显著提高（P＜0.05）。ICC是胃肠道起搏器区的起搏细胞[20]，已有研究表明，STC患者结肠ICC显著降低[21]；槐黄丸治疗后STC大鼠便秘缓解后结肠中c-kit和SCF的基因和蛋白水平显著升高[22]。如图2和图3所示，此试验发现经中、高剂量竹盐干预后可以显著提高便秘模型小鼠肠道组织中c-Kit蛋白的表达量和SCF mRNA的表达量，这说明竹盐可能通过c-kit/SCF通路促进ICC增殖，进而起到改善肠道平滑肌收缩而缓解便秘症状的作用。

图2 SCF mRNA在结肠组织中的表达水平（n=3）

图3 c-kit蛋白在结肠组织中的表达水平

2.5 竹盐对便秘小鼠结肠组织cAMP mRNA和VIP、PKA、AQP3蛋白表达水平的影响

RT-qPCR分析发现模型组肠道组织中cAMP的mRNA相对表达量较空白组极显著减少（P＜0.01），经低、中、高剂量的竹盐和枸橼酸莫沙必利干预后，便秘模型小鼠肠道组织中cAMP的mRNA的表达量都有了显著提高（P＜0.05或P＜0.01），如图4所示。经WB检测发现，与空白组相比，模型组结肠中VIP、PKA、AQP3蛋白表达明显减少（P＜0.05），竹盐低剂量组较模型组VIP、PKA、AQP3蛋白表达无显著性差异，竹盐中高剂量组和枸橼酸莫沙必利组VIP、PKA、AQP3蛋白表达水平与模型组相比明显升高（P＜0.05或P＜0.01），如图5所示。VIP是一种由上端小肠内分泌细胞分泌的胃肠激素，可缓解平滑肌紧张、保护胃肠道黏膜、调节肠道吸收。Tomita[23]和King等[24]研究显示STC患者的直肠黏膜和黏膜下组织SP活性明显降低，结肠VIP水平明显降低。有研究表明，VIP含量的降低，可能会引起结肠出现过度的阶段性蠕动，减弱结肠的有效推动[25]。AQP3主要分布于从口腔到胃以及从结肠到肛门段的消化道黏膜上皮，参与胃肠道水分运输的调节[26]。Zhi等[27]研究显示慢传输便秘模型大鼠近端结肠AQP3表达下降。Itoh等[28]研究发现VIP可通过影响肠上皮细胞中水通道蛋白3的表达来调节肠道水代谢，细胞内的cAMP与PKA结合，调节细胞功能，发挥相应的生理作用。周永学等[29]提出了VIP/cAMP/PKA/AQP3水液代谢通路。Cong等[30]发现便秘大鼠肠道水代谢的机制与VIP/cAMP/PKA/AQP3信号通路有关。此研究中高剂量的竹盐对STC小鼠进行干预后，VIP、PKA、AQP3的蛋白表达和cAMP的mRNA表达较模型组都有了显著增高。说明竹盐抗便秘作用可能与VIP/cAMP/PKA/AQP3信号通路有关。

图4 cAMP mRNA在结肠组织中的表达水平（n=3）

图5 VIP、PKA、AQP3蛋白在结肠组织中的表达水平

3 结论

此次研究结果显示：与模型组相比，竹盐中高剂量组和枸橼酸莫沙必利组中STC小鼠结肠组织肌层逐渐变厚，杯状细胞增多，缓解了便秘导致的黏膜损伤；与模型组相比，中高剂量竹盐和枸橼酸干预后明显增加了STC小鼠肠推进率和血清中Gas和SP含量，减少了NO含量，促进了结肠组织中c-kit、VIP、PKA、AQP3蛋白表达水平和SCF、cAMP的mRNA的相对表达，均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。竹盐对盐酸洛哌丁胺诱导的STC小鼠具有通便作用，可能通过调节SCF/c-kit和VIP/cAMP/PKA/AQP3信号通路达到缓解便秘效果，该研究为开发相关功能性食品提供理论基础和科学依据。

邓志敢等[31]发现随着竹盐煅烤次数的增加，有益矿物元素钙、镁、磷、钾、铁含量在竹盐内不断富集。而所用竹盐经过九次煅烤，含有大量矿物质，其中包括镁离子和硫化物，由此推测竹盐基于VIP/cAMP/PKA/AQP3通路的抗便秘作用可能与其含有大量镁离子有关，基于SCF/c-kit通路对便秘的缓解作用可能与其含有硫化物有关。竹盐中是否存在其他助于缓解便秘的成分还有待于进一步分析。

综上所述，九烤竹盐可能通过激活SCF/c-kit通路和VIP/cAMP/PKA/AQP3信号通路改善STC模型小鼠的便秘症状和肠道功能。该研究结果为开发竹盐相关功能性食品提供理论基础和科学依据。