蟾蜍油炮制工艺及质量评价方法研究△

牟丽燕，高萌，陆兔林，毛春芹，季德，苏联麟，郭志俊，高波，罗川，殷放宙*

1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210000；2.江苏省中药炮制重点实验室，江苏 南京 210000；3.华润三九现代中药制药有限公司，广东 惠州 516000；4.安徽华润金蟾药业有限公司，安徽 淮北 235000

哈蟆油为蛙科动物中国林蛙雌蛙的输卵管，1985 年被载入《中华人民共和国药典》，目前已被广泛地应用于药品、保健品、食品等中。目前，哈蟆油存在着供不应求的情况，急需寻找代替哈蟆油的新药源。现有研究表明，蟾蜍油来自中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor 雌蟾蜍的干燥输卵管，其化学成分与药理作用与哈蟆油较相似，两者均含有蛋白质、氨基酸、脂肪酸、微量元素、磷脂、核苷等，仅在部分成分的含量上有所差异[1-4]，此外蟾蜍油与哈蟆油均具有抗疲劳、抗衰老、抗应激、免疫调节等多种药理活性[3-5]。因此，有必要对蟾蜍油进行深入研究，以缓解哈蟆油资源短缺问题，还可以使蟾蜍资源得到充分利用。但目前缺乏蟾蜍油加工工艺及其质量评价的相关研究。在蟾蜍油加工过程中，干燥是重要环节，其对蟾蜍油药效成分具有重要影响。中药指纹图谱具有特征性、整体性等特点，能较全面地反映中药中化学成分的种类与含量，实现对中药质量的全面表征。动物药的主要成分为蛋白质、多肽及氨基酸，其水解产物主要为氨基酸[6]，某些动物药发挥药效的物质基础与氨基酸有关[7-11]。结合文献[1-2,4]及本课题组前期超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱法（UHPLC-Q-TOFMS/MS）、气相色谱-质谱法（GC-MS）研究结果表明，蟾蜍油中氨基酸类成分的含量较高。研究发现，异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸具有抗氧化和免疫调节作用[12-14]，与蟾蜍油药理作用一致，推测其为蟾蜍油的活性成分。因此，本研究以氨基酸及浸出物为指标，对蟾蜍油干燥工艺进行考察，并采用高效液相色谱法（HPLC）建立了蟾蜍油的指纹图谱，同时对其氨基酸的含量进行测定，可为蟾蜍油的加工炮制及质量评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器

2998 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；SQP 型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius 公司）；DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；FD-IA-50 型冷冻干燥机（上海利闻科学仪器有限公司）；DZF-6090X 型真空干燥箱（上海鳌珍仪器制造有限公司）；HH 型数显恒温水浴锅（江苏金坛金城国胜实验仪器厂）；KQ-500E型超声清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸（批号分别为112D022、416B029、718C024、804B0210，翼飞雪生物科技有限公司，纯度均≥99%）；乙腈为色谱级；水为超纯水；其余试剂为分析级。

1 批蟾蜍油鲜品来自山东，15 批蟾蜍油干品分别来自山东（S1～S5）、江苏（S6）、安徽（S7～S9）、河南（S10～S12）、黑龙江（S13～S15），所有样品经南京中医药大学陆兔林教授鉴定为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor 雌蟾蜍的输卵管。

2 方法与结果

2.1 蟾蜍油干燥工艺优化

取1 批蟾蜍油鲜品，以样品干燥呈不规则块状或呈鸡肠样、表面黄白色至黄棕色、无光泽为标准，考察热风干燥、自然阴干、冷冻干燥和真空干燥对蟾蜍油的影响，按干燥品计算氨基酸和浸出物含量，并以其为指标，采用全概率评分法优选最佳工艺。按公式（1）计算全概率评分（P）。

式中Xij表示第j个指标下的第i个测定值，Sj表示第j个指标下各次结果的和。

2.1.1 氨基酸含量的测定

2.1.1.1 色谱条件 Waters XBridge C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1 mol·L–1乙酸钠溶液（用乙酸调pH 至6.5，7∶93，A）、乙腈-水（4∶1，B）为流动相梯度洗脱（0～2 min，0～10%B；2～15 min，10%～25%B；15～20 min，25%～30%B；20～25 min，30%～100%B；25～30 min，100%B），检测波长为254 nm，流速为1 mL·min–1，柱温为43 ℃，进样量为10 μL。

2.1.1.2 对照品溶液的制备 取异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸对照品适量，精密称定，加入0.1 mol·L–1盐酸制成质量浓度分别为0.618、0.737、0.499、0.860 mg·mL–1的混合对照品溶液。

2.1.1.3 供试品溶液的制备 取蟾蜍油粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置水解管中，加5 mol·L–1盐酸5 mL，150 ℃水解1 h，放冷，移至蒸发皿中，用水10 mL 分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1 mol·L–1盐酸溶解，移至10 mL 量瓶中，加0.1 mol·L–1盐酸至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.1.4 溶液衍生化 分别精密量取对照品或供试品溶液各1 mL，置5 mL量瓶中，加0.1 mol·L–1异硫氰酸苯酯的乙腈溶液1 mL，1 mol·L–1三乙胺的乙腈溶液1 mL，摇匀；室温放置1 h 后，加50%乙腈至刻度，摇匀，取1 mL，加正己烷1 mL，振摇，放置10 min，取下层溶液，过0.22 μm微孔滤膜。

2.1.1.5 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液，用0.1 mol·L–1盐酸稀释，得到一系列质量浓度的混合对照品溶液，进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，得异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸的回归方程分别为Y=1.22×107X–1.90×104（r=0.999 4）、Y=1.18×107X–3.49×104（r=0.999 4）、Y=1.02×107X–2.49×104（r=0.999 4）、Y=1.60×107X+7.55×104（r=0.999 5），表明异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸的质量浓度分别为0.077～0.309、0.092～0.368、0.062～0.250、0.108～0.430 mg·mL–1时与峰面积线性关系良好。

2.1.1.6 方法学考察 精密度试验：取混合对照品溶液，连续进样6 次，计算异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸峰面积的RSD 分别为0.69%、0.98%、0.79%、0.93%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样分析，计算4 种氨基酸峰面积的RSD 分别为1.74%、2.46%、0.97%、2.25%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批蟾蜍油样品6 份，每份0.5 g，精密称定，平行制备6 份供试品溶液，衍生化处理后进样测定，计算4 种氨基酸含量的RSD 分别为2.82%、1.68%、1.87%、1.46%，表明该方法重复性良好。

加样回收率试验：取样品粉末5份，每份0.25 g，精密称定，分别加入等量的混合对照品溶液，制备供试品溶液，衍生化处理后进样测定，结果4 种氨基酸平均加样回收率分别为97.78%、103.27%、100.74%、97.95%，RSD 分别为2.17%、0.84%、2.05%、1.02%，表明该方法准确可行。混合对照品和样品HPLC图见图1。

图1 混合对照品和蟾蜍油样品氨基酸测定HPLC图

2.1.2 热风干燥工艺

2.1.2.1 单因素试验 取蟾蜍油鲜品单层放置，分别在30、40、50、60、80 ℃干燥12 h，考察加热温度对样品的影响；取鲜品单层放置，分别在50 ℃加热9、10、11、12、13 h，考察加热时间对样品的影响；取鲜品分别按1、2、3层放置，50 ℃干燥11 h，考察物料厚度对样品的影响。观察各样本外观性状并测定水分、浸出物及氨基酸总量，计算P。结果显示，加热温度、加热时间均不影响蟾蜍油外观性状，当加热温度为30、40、50 ℃时，加热时间为9、10、11 h 时P较高；随物料厚度的增加，蟾蜍油黏结成块，当物料厚度为3 层时，蟾蜍油含水量较高，P随物料厚度的增加而逐渐降低，结果见图2。

图2 蟾蜍油热风干燥P 结果

2.1.2.2 正交试验 在单因素试验优化条件的基础上，设计L9（33）正交试验。以氨基酸总量及浸出物含量为指标，结合外观性状及水分含量优选最佳工艺，正交试验结果见表1。由极差分析结果可知，影响结果的因素依次为物料厚度>加热时间>加热温度，方差分析结果显示，三因素对试验结果的影响差异无统计学意义。综合直观分析及极差分析可知，蟾蜍油热风干燥最佳工艺为取单层蟾蜍油平铺，设定加热温度50 ℃，干燥11 h。

表1 蟾蜍油热风干燥正交试验结果

2.1.3 其他干燥工艺 本研究分别对自然阴干、冷冻干燥及真空干燥工艺进行了考察。取蟾蜍油鲜品单层放置，置阴凉通风处晾干[（22±3）℃，相对湿度65%，5 d]，间隔翻动，考察自然阴干对样品的影响；取蟾蜍油鲜品单层放置，采用真空干燥，分别在40 ℃干燥10 h、50 ℃干燥8 h、60 ℃干燥6 h、70 ℃干燥5 h，考察真空干燥对样品的影响；取蟾蜍油鲜品单层放置，采用冷冻干燥，分别预冻5 h 干燥13 h、预冻4 h 干燥14 h、预冻3 h干燥15 h、预冻2 h干燥16 h，考察冷冻干燥对样品的影响。观察各样本外观性状并测定浸出物及氨基酸总量，计算P。

比较确定的最佳热风干燥工艺与其他工艺P。由表2 可知，不同干燥工艺结果相近，因企业具有热风干燥设备且热风干燥成本低、效率高，在工业生产中应用广泛，因此确定取单层蟾蜍油平铺，50 ℃热风干燥11 h为最佳炮制工艺。

表2 蟾蜍油不同干燥工艺考察结果（n=3）

2.2 蟾蜍油HPLC指纹图谱的建立

2.2.1 供试品溶液的制备 取蟾蜍油粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，称质量，超声处理30 min（250 W，20 kHz），放冷，称质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.2.2 色谱条件 Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以水（A）-乙腈（B）为流动相梯度洗脱（0～5 min，15%～85%B；5～15 min，85%～90%B；15～20 min，90%～100%B；20～25 min，100%B；25～30 min，100%～15%B），检测波长为210 nm，流速为1 mL·min–1，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。

2.2.3 方法学考察 精密度试验：取同一份供试品溶液，连续进样6次，以7号峰为参照峰，结果各共有峰相对保留时间的RSD为0.03%～0.16%，相对峰面积的RSD 为0.45%～4.41%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样分析，计算各共有峰相对保留时间的RSD为0.08%～0.41%，相对峰面积的RSD为2.52%～4.87%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

加样回收率试验：取同一批样品6 份，制备供试品溶液并进样分析，计算各共有峰相对保留时间的RSD 为0.08%～0.32%，相对峰面积的RSD 为0.42%～4.98%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 蟾蜍油指纹图谱的建立与相似度评价 取15批蟾蜍油粉末，制备供试品溶液，进样检测。将所得的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012A 版），以S1 样品的色谱图为参考图谱，以中位数法生成对照图谱，时间窗宽度为0.1 min，采用多点校正，选择分离度及峰形较好的7 个色谱峰作为共有峰，进行Mark峰匹配，生成叠加指纹图谱和对照指纹图谱（R），结果见图3。以7 号峰为参照峰，样品指纹图谱共有峰相对保留时间的RSD 为0.10%～0.48%，相对峰面积的RSD 为8.43%～25.59%。以S1 样品图谱为参照图谱，对蟾蜍油的指纹图谱进行相似度评价，结果显示与对照指纹图谱相比，S1、S2、S4、S5 相似度为0.999，S3、S10～S12 相似度为1.000，S6、S13、S14 相似度为0.995，S7～S9 相似度为0.997，S15 相似度为0.996，相似度均大于0.99，说明不同批次蟾蜍油的整体质量较为接近。

图3 15批蟾蜍油样品的HPLC指纹图谱

2.2.5 聚类分析 采用IBM SPSS Statistics 26 软件对指纹图谱数据进行聚类分析，以7 个共有峰的相对峰面积为变量，采用组间联接法，以欧氏距离为测度，对15 批蟾蜍油进行系统聚类分析，结果见图4A。当欧氏距离为5 时，15 批样品被聚为三大类：S1～S5、S7～S9 聚为一类，S10～S12 聚为一类，S6、S13～S15聚为一类。

图4 15批蟾蜍油聚类分析树状图及PCA图

2.2.6 主成分分析（PCA）将15批蟾蜍油的7个共有峰峰面积导入IBM SPSS Statistics 26 软件进行PCA，以特征值>1为标准，确定了2个主成分因子，主成分1 的特征值为5.626，方差贡献率为80.368%；主成分2 的特征值为1.014，方差贡献率为14.482%，两者的累积方差贡献率为94.850%，表明前2个主成分可以代表蟾蜍油指纹图谱共有峰的大部分信息。主成分载荷矩阵结果显示，主成分1主要反映了色谱峰1～2、4～7 的信息，主成分2 主要反映了色谱峰3 的信息。以前2 个主成分对15 批蟾蜍油进行综合评价，以方差贡献率为分配系数，计算各批次蟾蜍油的主成分得分及综合得分。以综合得分值的大小评价各产地蟾蜍油的质量，结果见表3。样品S12、S11、S10 为综合得分的前3 名，说明这3批样品质量较好。将共有峰峰面积导入SIMCA 14.1软件进行PCA，得到PCA散点图，见图4B，样品按产地聚为3类。

表3 15批蟾蜍油主成分得分、综合得分及排名

2.3 蟾蜍油氨基酸含量的测定

取15 批蟾蜍油粉末，按2.1.1.3 项下方法制备供试品溶液并经衍生化处理后进样分析，不同批次蟾蜍油中各氨基酸含量存在差异，异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸质量分数分别为0.40%～0.57%、0.57%～0.78%、0.54%～0.75%、0.26%～0.86%，结果见表4。

表4 15批蟾蜍油氨基酸质量分数测定结果%

3 讨论

氨基酸含量研究中分别对盐酸浓度（4、5、6 mol·L–1）和水解时间（0.5、1.0、1.5 h）进行了考察，确定最佳样品制备方法。指纹图谱研究中分别对提取溶剂（石油醚、乙酸乙酯、甲醇）、提取时间（20、30、40 min）进行了考察，确定了最佳的样品制备方法；考察供试品溶液在200～400 nm 吸收波长情况。结果表明，在210 nm 波长处色谱峰数量较多、基线较平稳；此外，还对甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液4 种流动相进行了考察。结果显示，以乙腈-水为流动相时，各色谱峰的分离度较好，且基线平稳。

热风干燥具有成本低、操作简单等优点，在工业生产中广泛应用。因此，本研究对热风干燥展开了考察；真空干燥采用抽真空和加热同时进行，可加快水分蒸发，缩短干燥时间；冷冻干燥能够保持产品原有的色、香、味、形及营养成分；自然阴干是传统干燥方式。本研究对热风干燥、真空干燥、冷冻干燥、自然阴干进行了考察。真空干燥中考察了加热温度和加热时间对蟾蜍油的作用效果，结果显示真空干燥温度和干燥时间不影响蟾蜍油外观性状且样品干燥适度，50 ℃加热8 h 时P最高，效果最好。冷冻干燥中考察了预冻时间和冷冻干燥时间对蟾蜍油的作用效果，结果显示冷冻干燥后蟾蜍油颜色变白、质地酥脆，预冻时间和冷冻干燥时间对蟾蜍油影响差异无统计学意义。自然阴干不影响蟾蜍油的外观性状且样品干燥适度。不同干燥工艺结果相近，因企业具有热风干燥设备且热风干燥成本低、效率高，因此，确定取单层蟾蜍油平铺，50 ℃热风干燥11 h 为最佳炮制工艺。各批样本指纹图谱相似度均在0.99 以上，说明不同批次蟾蜍油化学成分种类差异无统计学意义，但各共有峰相对峰面积的RSD 差异大，表明各共有峰所代表的化学成分含量存在一定差异。采用聚类分析及PCA 对不同产地样品指纹图谱数据进行分析。聚类分析结果显示，样品按产地聚为不同的类别，安徽与山东产地的聚为一类，江苏与黑龙江产地的聚为一类，河南产地的单独聚为一类。由于江苏的样本只有1 例，其聚类结果有待商榷，后期增加样本量来确认此结果。PCA 结果显示，不同产地蟾蜍油质量存在一定的差异性，样品S12、S11、S10 质量较好，PCA 得分图显示，结果与聚类分析结果一致。氨基酸含量测定结果显示，不同批次蟾蜍油中氨基酸含量存在差异，推测造成这种差异的原因可能与产地、生长年限及养殖方式有关。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。