外周血淋巴细胞数量改变与华中地区肌萎缩侧索硬化症患者疾病进展的关联*

龚振翔, 侯红艳, 巴 黎, 李泽慧, 彭思锐, 张 旻△

华中科技大学同济医学院附属同济医院 1神经内科 2检验科,武汉 430030

肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种以上、下运动神经元(motor neurons,MNs)同时受累为特征的致死性神经系统变性疾病,临床表现为进展性加重的全身肌肉无力和萎缩,确诊患者通常在3～5年内死于严重的肺部感染和呼吸衰竭[1]。研究发现,线粒体功能障碍、谷氨酸兴奋毒性、外周免疫系统(peripheral immune system,PIS)和中枢免疫系统(central immune system,CIS)异常等均参与了ALS的神经元死亡过程。但目前ALS的发病机制仍未完全明确,因此在治疗上仍面临药物种类少、效果差的难题。近年来ALS已被证实是一种非神经元自主性疾病,胶质细胞和中枢神经系统(central nervous system,CNS)内浸润的外周免疫细胞[2-7]在MNs的变性中发挥了至关重要的作用,促炎的神经免疫微环境参与了ALS发生发展的全过程[8-9]。最新的研究证据显示CIS与PIS之间的“免疫串扰”会加速MNs的变性过程,PIS异常与疾病进展的关联已成为ALS领域的研究热点。但多数研究只关注了ALS患者与健康对照之间外周血淋巴细胞的区别,仅有少量研究探讨了外周血淋巴细胞与ALS疾病进展的关系,且并未对淋巴细胞亚群进行精细的免疫分型。针对亚洲人群,尤其是中国ALS患者外周血淋巴细胞亚群的研究尤为缺乏。本研究对133名来自华中地区的ALS患者进行外周血淋巴细胞亚群的详细检测,分析了其与疾病进展的关系,为进一步阐明ALS患者的PIS异常奠定基础,同时也为寻找延缓ALS疾病进展的治疗靶点提供思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究纳入了2020年1月至2023年5月在华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科就诊的133名来自华中地区(河南省、湖北省、湖南省)的ALS患者。项目获得华中科技大学同济医学院附属同济医院医学伦理委员会的批准(批准号:TJ-IRB20201219),所有参与者均签署了知情同意书。具体纳入标准如下:①年龄≥18岁,根据修订版El Escorial标准[10]诊断为可能、很可能和确诊的ALS;②肝肾功能正常。排除标准为:①合并其他神经系统变性疾病、免疫系统疾病或血液病;②存在急性感染或慢性传染性疾病活动状态的证据,如可检出乙肝DNA拷贝,人类获得性免疫缺陷病毒携带等。

1.2 临床资料收集

收集ALS患者年龄、身高、体重、病程、既往病史等资料。使用修订版肌萎缩侧索硬化功能评分(Revised ALS Functional Rating Scale,ALSFRS-R)对患者进行运动功能评估(满分为48分,分数越低代表运动功能越差)[11],计算得到疾病进展率=(48分-入院时ALSFRS-R得分)/病程月数。根据既往文献,将疾病进展率>0.5者判定为快进展组,疾病进展率≤0.5者判定为慢进展组[12]。同时,根据国王临床分期(King’s ALS clinical staging)系统,将ALS患者分为一期至四期4个临床阶段,从一期至四期受损的运动功能域依次增多[13]。

1.3 慢进展组与快进展组ALS患者外周血淋巴细胞亚群分析

使用含肝素钠的真空采血管于清晨6～7时采集所有患者空腹状态下的静脉血,并在1 h内转运至实验室进行样本处理。具体流程如下:将50 μL全血与6色混合TBNK抗体(BD Biosciences,662967)在室温下孵育15 min,加入450 μL FACS裂解液(BD Biosciences,555899)后,用FACS Canto流式细胞仪和FACS Canto临床软件对数据进行分析,对CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞进行分群。再取3份体积为100 μL的全血,分两组对淋巴细胞亚群进行更为详细的分类和测定。第一组使用的抗体组合为anti-CD45-PerCP(BD Pharmingen,2D1),anti-CD3-APC-H7(BD Pharmingen,SK7),anti-CD4-V450(BD Pharmingen,RPA-T4),anti-CD8-PE/Cy7(BD Pharmingen,SK1),anti-CD28-PE(BD Pharmingen,L293),以及anti-HLA-DR-APC(BD Pharmingen,L243)。第二组使用的抗体组合为anti-CD45-PerCP(BD Pharmingen,2D1),anti-CD3-APC-H7(BD Pharmingen,SK7),anti-CD4-BV510(BD Pharmingen,SK3),anti-CD45RA-FITC(BD Pharmingen,L48),anti-CD8-PE/Cy7(BD Pharmingen,SK1),anti-CCR7-PE(BD Pharmingen,3D12),anti-CD25-APC(BD Pharmingen,2A3)及anti-CD127-BV421(BD Pharmingen,HIL-7R-M21)。有关流式细胞术更为具体的参数及方法参考既往同济医院检验科已发表的论文[14]。

1.4 统计学方法

使用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的连续型数据以均数±标准差表示,组间均数比较采用独立样本t检验。不符合正态分布的连续型数据以M(P25,P75)表示,组间比较采用曼-惠特尼U检验。计数资料以频数表示,组间比较采用卡方检验。使用二元Logistic回归分析外周血淋巴细胞亚群与ALS疾病进展的关系,结果表示为OR(95%CI)。以P<0.05为差异有统计学意义(双侧检验)。

2 结果

2.1 慢进展组与快进展组ALS患者人口学资料的比较

根据患者的疾病进展率,69名ALS患者纳入快进展组,64名ALS患者纳入慢进展组。两组患者的年龄平均值均为56岁,在性别构成、身高和体重上两组患者间差异无统计学意义(均P>0.05)。在慢进展组和快进展组临床特征的比较中,慢进展组患者的平均起病年龄为54岁,快进展组患者的平均起病年龄为55岁(P>0.05),两组患者球部和肢体起病人数的构成比差异亦无统计学意义(P>0.05)。慢进展组患者ALSFRS-R评分中位数高于快进展组(44分vs.38分,P<0.01),同时慢进展组患者的病程中位数长于快进展组(14月vs.8月,P<0.01),见表1。

表1 人口学及临床特征或M(P25,P75)]Table 1 Demographic and clinical characteristics

2.2 慢进展组与快进展组ALS患者血常规数据的比较

在进行外周血淋巴细胞亚群的分析前,本研究首先对慢进展组患者和快进展组患者的血常规数据进行了比较。两组患者在红细胞计数、白细胞计数、血小板计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数、嗜酸性粒细胞计数、嗜碱性粒细胞计数和血红蛋白浓度上差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 慢进展组与快进展组ALS患者血常规数据比较或M(P25,P75)]Table 2 Comparison of blood routine data between ALS patients with slow and fast or M(P25,P75)]

2.3 慢进展组与快进展组ALS患者淋巴细胞亚群数据的比较

通过流式细胞术和流式细胞分析软件,本研究共对29种外周血淋巴细胞亚群指标进行了统计分析。其中,慢进展组患者总T淋巴细胞(CD3+CD19-)比例显著低于快进展组患者(P<0.05),慢进展组患者辅助性T细胞比例低于快进展组患者(P<0.05)但其计数在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。慢进展组患者NK细胞计数和NK细胞比例均显著高于快进展组患者(均P<0.05),同时慢进展组患者表达第二信号受体的辅助性T细胞(CD28+Th)占辅助性T细胞的比例显著高于快进展组(P<0.05)。在其他淋巴细胞亚群的比较中,未发现慢进展组与快进展组患者存在具有统计学意义的差异。见表3。

表3 慢进展组与快进展组ALS患者淋巴细胞亚群的比较或M(P25,P75)]Table 3 Comparison of lymphocyte subgroups between ALS patients with slow and fast or M(P25,P75)]

2.4 NK细胞计数与患者疾病进展率的相关性分析

在控制性别、年龄、身高、体重等混杂因素的前提下,以慢进展组和快进展组外周血淋巴细胞亚群比较中差异具有显著性意义的淋巴细胞亚群指标(总T淋巴细胞比例、NK细胞计数以及CD28+Th/Th)作为自变量,以疾病进展分组作为因变量,进行二元Logistic回归分析。结果显示,NK细胞计数的OR(95%CI)为0.992(0.986,0.997)(P<0.05),CD28+Th/Th的OR(95%CI)为0.895(0.818,0.979)(P<0.05),即NK细胞计数、CD28+Th细胞与Th细胞的比值升高是ALS疾病进展的保护性因素。见表4。

表4 外周血淋巴细胞亚群与ALS疾病进展的Logistic回归分析Table 4 Logistic regression analysis of peripheral blood lymphocyte subgroups and ALS progression

3 讨论

本研究通过对来自华中地区的133名ALS患者进行疾病进展评估和外周血淋巴细胞亚群测定,发现慢进展的ALS患者外周血NK细胞数量、CD28+Th/Th比值显著高于快进展的ALS患者,NK细胞数量和Th细胞表面CD28的高表达是ALS疾病进展的保护性因素。NK细胞是固有免疫系统最重要的组成部分,固有免疫系统异常可能参与了ALS的进展过程。

既往有关ALS外周免疫特征的研究多数关注ALS患者与健康对照之间的区别,只有少数研究初步探讨了外周血淋巴细胞改变和ALS进展的关系[15]。在一项纳入了119名ALS患者的纵向队列研究中发现中性粒细胞的增多和Th细胞的减少是ALS疾病进展的危险因素[16]。另一项纳入了90名ALS患者的横断面研究报导了CD16-单核细胞的减少以及中性粒细胞与CD16-单核细胞比值的降低与ALS的疾病进展有关[17]。此外,还有两项临床研究发现外周血调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)数量的减少与ALS的进展相关,但其中一项使用的病情评估工具并非标准化的ALSFRS-R评分[18],另一项研究则仅纳入了33名ALS患者[19]。与既往研究不同,本研究发现快进展与慢进展ALS患者外周血淋巴细胞最显著的差异在于慢进展ALS患者的NK细胞数量更多,并首次发现Th细胞表面第二信号受体CD28的表达可能是ALS进展的保护性因素。

近年来,固有免疫系统,尤其是NK细胞,在ALS的研究中受到越来越多的关注。NK细胞是一类在固有免疫反应中起关键作用的淋巴细胞,它们能够识别并摧毁异常的或受到病原体感染的细胞[20],并作为连接固有免疫与适应性免疫的重要桥梁参与了对适应性免疫的调节[21]。在ALS疾病进展的过程中,脊髓内异常激活的小胶质细胞所导致的高炎症水平是促使运动神经元死亡的重要原因[22-23]。早期的动物研究发现,ALS模型小鼠(SOD1G93A)的脊髓中除了有T细胞的浸润外,还有NK细胞的浸润,且脊髓内NK细胞的浸润在疾病的早期最为明显,提示在ALS病理过程启动后NK细胞在脊髓免疫微环境的调控中发挥了重要作用[24]。且最近的研究证据显示,病理状态下,CNS中浸润的免疫细胞很大程度上依赖于外周向中枢的趋化和募集。与T细胞类似,NK细胞也具有不同的免疫表型,CD16-CD56brightNK细胞是人体分泌γ-干扰素的主要NK细胞亚群,而CD16+CD56dim细胞则是人体内行使细胞毒性和杀伤作用的主要NK细胞亚群[25-26]。最近的一项研究发现,症状前期的SOD1G93A小鼠脊髓中有NKp46+的活化NK细胞浸润,该亚型的NK细胞高表达颗粒酶B和细胞毒性因子CD69,对运动神经元有一定程度的杀伤作用[27]。而在自身免疫性脑脊髓炎小鼠中由外周募集至硬脊膜淋巴管的NK细胞则可以通过分泌γ-干扰素诱导脊髓内的星形胶质细胞发生表型转化,高表达溶酶体相关膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein 1,LAMP1)和促凋亡死亡受体配体(CD253),进而诱导脊髓内的细胞毒性T细胞发生凋亡,以发挥抑制炎症反应、维持脊髓内免疫微环境平衡的作用[28]。本研究中快进展组患者外周血淋巴细胞中NK细胞数量较低,可能引起由PIS向CIS募集的NK细胞不足,导致CNS中缺乏足够数量的NK细胞参与MNs所在的免疫微环境的调节。在既往的临床研究中,有报道称慢进展ALS患者外周血中CD16dimCD56brightNK细胞数量增多[29];ALS患者外周血中NK细胞上NKp30的表达量与ALSFRS-R评分的变化呈负相关关系。此前本团队的一项孟德尔随机化研究证实,CD16-NK及HLA-DR+NK细胞表面CD56表达量的升高是ALS的保护性因素[30],从另一个侧面印证了本研究的发现。当然,如果想更为深入地探讨NK细胞参与ALS疾病进展的机制,还需要在后续的研究中对ALS患者外周血和脑脊液中的NK细胞进行更多的表面标志物鉴定。

第二信号受体CD28是T细胞表面的一类共刺激分子,CD28与抗原递呈细胞表面上的分子结合,能促进T细胞的存活、增殖以及信号转导。CD28+Th细胞是一种活化的Th细胞亚群,具有下调高免疫炎症水平的作用,对于维持体内Treg细胞的数量和正常功能至关重要[31-32]。临床研究发现,快速进展的ALS患者外周血中Treg细胞减少,而最新的小规模临床随机对照研究显示,体外扩增回输Treg细胞可以减缓ALS患者的进展[33]。因此,CD28分子是未来ALS研究中值得探讨的免疫调节新靶点。

本研究也存在一定的局限性。首先,本研究为单中心研究,样本量相对较小,所得结论有待于更大样本量的多中心研究进一步验证;其次,由于ALS患者ALSFRS-R评分的下降是非线性的,根据入院时ALSFRS-R评分计算的疾病进展率对患者的疾病进展进行分类并不完全准确,未来通过纵向队列研究,动态随访和收集ALSFRS-R评分随病程变化的数据,所得到的结论将更具科学性。