超声处理时间对莲藕淀粉理化和结构特性的影响

廖雪勤，汪 楠，胡 荣，薛冰洁，张甫生,3，郑 炯,3,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.食品科学与工程国家级实验教学示范中心（西南大学），重庆 400715；3.川渝共建特色食品重庆市重点实验室，重庆 400715）

莲藕属于睡莲科多年生植物，目前在中国有3 000多年的栽培历史，种植范围广泛。莲藕的营养价值很高，富含蛋白质、淀粉、纤维素、脂肪、维生素、矿物质等多种对人体有益的成分[1]。莲藕淀粉（lotus root starch，LS）是莲藕的主要成分之一，其中直链淀粉含量为22%～51%，支链淀粉含量为35%～45%[2]。虽然LS已作为增稠剂、稳定剂和胶凝剂等广泛应用于食品加工，但天然的LS仍存在对加工条件耐受性差、易回生、透明度低等问题[3]。这是由于紧密排列的直链淀粉分子导致淀粉粒硬度增大、不溶于水，从而降低了LS的糊化和凝胶形成能力[4]。此外，浸出的直链淀粉分子和解聚的支链淀粉糊化后再结晶进一步导致了LS易回生[5]，这些问题限制了其在食品工业中的应用。因此，需要采用有效的技术手段对天然LS进行改性以提高其品质。

淀粉改性常采用物理、化学、生物方法，其中物理方法中的超声技术具有改性效果优良、环境友好、能耗较低等优点，是一种很有前景的技术[6]。研究表明，高超声功率能有效改变淀粉的糊化温度和焓值，改善淀粉的糊化回生性能[7]，使淀粉颗粒表面出现孔洞和凹槽[8]，并破坏淀粉的结晶区域，使短程有序结构增多，而较低的超声功率对淀粉结构和理化特性影响较小[9]。目前，超声波技术在淀粉改性中的研究大多数集中于不同超声处理功率对淀粉的影响方面，关于不同超声处理时间对淀粉理化性质及多尺度结构影响的报道较少。因此，本研究通过测定不同超声处理时间（0、10、20、30、40、50 min）对LS的糊化、流变特性以及多尺度结构的影响，并采用扫描电镜、红外光谱、X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）等对其颗粒形貌、短程有序结构、结晶结构进行表征，以期为超声技术在LS性能改善及品质调控中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

LS（淀粉质量分数高于93%）湖北爱荷食品有限公司；氯化钠、尿素、溴化钾（化学纯）成都市科隆化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

JA2003电子分析天平 上海良平仪器仪表有限公司；JY99-IIDN超声波细胞粉碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；TecMaster快速黏度分析仪 澳大利亚Perten公司；DHR-1流变仪、New Castle DE差示扫描量热仪（differential scanning calorimetry，DSC）美国TA公司；JSM-6490LV扫描电镜 日本电子公司；NanoSTAR小角X射线散射仪（small angle X-ray scattering，SAXS）、AXS XRD仪 德国Bruker公司；Frontier MIR红外光谱分析仪 英国Perkin Elmer公司；AVANCE核磁共振（nuclear magnetic resonance spectra，NMR）仪 瑞士Brooke Beurspine公司。

1.3 方法

1.3.1 样品超声处理

将24 g LS和120 mL蒸馏水均匀混合于200 mL烧杯中，置于超声波细胞粉碎仪，设置超声强度为73.3 W/cm2，超声时使用1∶1的占空比（脉冲时间5 s、间歇时间5 s）分别处理0、10、20、30、40、50 min。超声作用时，利用冰水浴控制反应体系温度不超过25 ℃，处理后的样品冷冻干燥后用于后续指标测定。以超声处理时间为0 min的样品为对照组（CK）。

1.3.2 糊化特性测定

将3 g超声处理后的LS分散于25 mL蒸馏水中，充分混合均匀，得到的悬浮样品于快速黏度分析仪的专用测试铝盒中检测糊化性能。测试程序参照文献[10]。在50 ℃保温1 min，以12 ℃/min的速率升温到95 ℃，并在95 ℃保温2.5 min，然后以12 ℃/min的速率降温至50 ℃，并在50 ℃保温2 min。

1.3.3 流变特性测定

取糊化后的样品立刻转移至流变仪测定平台上测定，选择直径为40 mm的平板，设置平板间隙为1 000 μm，上样平衡时间为30 s，测试温度为25 ℃。

1.3.3.1 静态流变特性测定

采用两步程序测试样品的触变性，测试程序：剪切速率从0 s-1增加至300 s-1（上行），再从300 s-1下降至0 s-1（下行）。

流变模型拟合分析：依据剪切应力（τ）与剪切速率（γ）的关系，运用幂律定理（Power-Law模型）对数据进行拟合，方程如式（1）所示：

式中：τ为剪切应力/Pa；K为稠度系数/（Pa·sn）；γ为剪切速率/s-1；n为流体指数。

1.3.3.2 动态黏弹特性测定

在0.1～10 Hz频率范围内，在1%应变条件下，测量线性黏弹性区域内的储能模量（G′）、损耗模量（G″）和损耗角正切值tanδ＝G″/G′。

1.3.4 热力学特性测定

通过DSC分析样品的热力学特性，参照Ding Yongbo等[11]的方法，将5 mg超声LS悬浮液和10 μL蒸馏水置于铝坩埚中，4 ℃平衡12 h，测定热稳定性，测量过程中的温度以10 ℃/min的速率从30 ℃上升到160 ℃。

1.3.5 淀粉颗粒形貌观察

采用扫描电镜对待测样品进行颗粒形貌观察。测试前，将待测粉末样品置于40 ℃烘箱内干燥12 h，取适量样品分散于贴有导电双面胶的载物台上，利用真空离子溅射仪喷金后，20.0 kV加速电压条件下拍摄图像，×4 000观察样品颗粒形貌。

1.3.6 层状结构测定

淀粉颗粒内部的层状结构通过SAXS测定。将样品配制成质量分数60%的淀粉乳，采用SAXS，在X射线波长为0.154 nm、电压50 kV、电流0.6 mA条件下测定样品的层状结构，使用Vantec-2000二维探测器[12]。参照Zhu Jie等[13]的方法获得分形和层状结构参数。散射强度I和散射角度q遵循Power-Law模型I～q-α，在低q范围内，一般采用I～q-α量化SAXS强度与分形结构的关系。α可由SAXS曲线在低q范围内的双对数标度斜率得到。

1.3.7 XRD测定

采用XRD分析仪对样品晶体结构进行分析，特征射线Cu靶-石墨单色器，管压40 kV，电流30 mA，测量角度范围2θ＝4°～40°，发射及防反射狭缝1°，接收狭缝为0.3 mm，扫描速度为2°/min，步宽0.02°。采用Jade 6.5软件处理衍射图谱，并将其分为微晶区、亚微晶区、非结晶区[14]，根据其计算样品的相对结晶度。三者比例以及相对结晶度分别按式（2）～（5）计算：

式中：IC1为微晶区面积；IC2为亚晶区面积；Iα为非晶区面积。

1.3.8 傅里叶变换红外光谱分析

称取样品（3.00±0.05）mg与预先研磨过的KBr粉末混合至总质量为（300.0±0.1）mg，以空气为背景采集红外光谱图，扫描64 次，分辨率为4 cm-1，波数范围为4 000～600 cm-1，并计算出R1047/1022值。

1.3.91H NMR测定

根据Wang Nan等[15]的方法，利用1H NMR分析淀粉样品的糖苷键比。将80 mg样品溶解在1 mL二甲亚砜中。在25 ℃测定得到样品的1H NMR。α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键分别在δ＝5.11和δ＝4.90处测定。采用软件MestReNova 14处理图谱，分支度（degree of branching，DB）按式（6）计算：

式中：Iα-1,4和Iα-1,6分别为α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键的1H NMR积分。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 超声处理时间对LS糊化特性的影响

峰值黏度反映了淀粉的最大溶胀力[16]。如表1所示，与CK相比，超声处理后的峰值黏度显著增加，这是因为超声会影响淀粉的非结晶区域，促使水分子进入，从而增强淀粉的溶胀能力[17]。超声处理10～30 min，峰值黏度和谷值黏度均随处理时间的延长而增加，并在30 min时分别达到最大值（6 059±31）mPa·s和（3 716±17）mPa·s，随后开始降低。这一结果表明过长时间的超声处理可能会破坏淀粉的颗粒结构，从而减少淀粉分子的溶胀和缠结[18]。Yang Wenhan等[19]研究发现，超声处理中强烈的剪切力、微射流和空化效应会诱导淀粉大分子长链断裂成许多短链，降低淀粉颗粒的完整性，从而导致终止黏度降低。崩解值可以表征淀粉糊的稳定性[19]，超声处理后样品的崩解值都增加，说明淀粉糊的稳定性下降。超声处理50 min时淀粉糊的稳定性相较于10～40 min有所增加，但仍小于CK。

表1 不同超声处理时间对LS糊化特性的影响Table 1 Effect of different ultrasound treatment time on the pasting properties of LS

由表1可知，LS的终止黏度随着超声处理时间的延长而增大，30 min时达到最大值（（4 580±15）mPa·s），这是因为短时间超声处理促进了淀粉的糊化，因此在回生过程中，淀粉链重结晶程度增大，淀粉的抗剪切能力增大。但长时间超声处理（40～50 min）对淀粉糊化的促进弱于短时间超声处理，导致终止黏度降低，但仍高于CK。LS的回复值随超声处理时间的延长先增大后减小，说明淀粉的短期回生程度先升高后降低，且高于CK。长时间超声处理使回复值降低，这是因为浸出的直链淀粉和长链支链淀粉断裂，淀粉聚合度降低[19]。这与Harpreet等[20]对小麦粉糊化特性的研究结论相似。超声处理后淀粉的糊化温度高于CK，这说明超声处理增强了淀粉颗粒对热的抵抗能力。而长时间超声处理后淀粉的糊化温度开始下降，这可能是由于支链淀粉被降解，促进了LS的糊化[20]。

2.2 超声处理时间对LS流变特性的影响

2.2.1 静态流变特性

由图1可知，所有样品黏度均随剪切速率增大而减小，表现出典型的剪切变稀现象，说明超声处理并未改变LS的假塑性流体特征。不同超声时间处理后LS的表观黏度和应力均增大，说明超声处理增强了淀粉凝胶的网络结构强度和流动阻力，这是因为超声的机械作用和空化效应使淀粉分子间作用力增强[21]。在超声处理10～30 min内，淀粉糊的表观黏度和剪切应力随时间延长而增大，继续延长处理时间，黏度和应力反而下降，这与糊化特性的分析结果相印证。长时间的超声处理破坏了淀粉链之间的氢键，降低了糊化程度，从而使黏度和剪切应力减小[22]。

图1 不同超声处理时间对LS静态流变特性的影响Fig.1 Effect of different ultrasound treatment times on the steady rheological properties of LS

采用Power-Law模型对所得数据进行拟合，如表2所示，R2均大于0.99，说明Power-Law模型对该样品静态流变数据具有较好的拟合度。与CK相比，超声处理后LS的K值增加，在30 min达到最大值115.03，说明其黏度增加，这是因为超声处理促进了淀粉链的缠结。但在超声处理30 min后，支链淀粉随着处理时间的延长而被破坏，导致K值降低。超声处理后n值降低表明淀粉糊假塑性增强，剧烈的剪切力导致淀粉降解，增强了假塑性[23]。超声处理后下行曲线K值与上行曲线K值变化趋势相似，且下行曲线K值的变化小于上行曲线K值的变化。这一现象表明，淀粉凝胶的内部结构被破坏后难以随着剪切力的减小而恢复。上行曲线和下行曲线围成的面积S即为淀粉糊的滞后环，反映了淀粉糊体系的触变性。S值随超声处理时间的延长而增大，在30 min时达到最大值29 540.29，随后开始降低，但均高于CK，说明超声处理使LS触变性增强。40～50 min的S值降低可能是由于超声时间过长导致淀粉分子链断裂，不利于稳定结构的形成。虽然该结构的抗剪切能力较强，但在破坏后难以恢复[23]。

表2 不同超声处理时间对LS流变曲线拟合参数的影响Table 2 Effect of different ultrasound treatment times on fitting parameters of rheological curves of LS

2.2.2 动态流变特性

超声处理后LS的动态流变特性如图2所示。所有样品的G′值均大于G″，说明LS的弹性强于黏性。这与超声处理玉米淀粉、马铃薯淀粉和豌豆淀粉的结果[24]一致。超声处理后淀粉的G′和G″均高于CK，这是由于超声处理破坏了淀粉分子无定型区的结构，更多水分子进入淀粉颗粒内，促进糊化，导致黏度升高，另外淀粉分子间的相互作用增大，缠结得更加稳固，形成了黏弹性更强的网状结构[24]。G′和G″均随超声时间的延长而增大，但G′在处理时间到达30 min后随时间延长而降低，这与静态流变特性的结果相似。淀粉分子尤其是直链淀粉在超声的作用下会重新排列形成双螺旋，从而增加淀粉凝胶的强度[25]，而在长时间的超声作用下，空化效应会使直链淀粉断裂，分子间缠结程度低，因此黏弹性降低。

图2 不同超声时间对LS动态流变特性的影响Fig.2 Effect of different ultrasound treatment times on the dynamic rheological properties of LS

2.3 超声处理时间对LS热学特性的影响

30～160 ℃内的两个糊化峰分别表示LS两种结构的熔解。第1个峰出现在30～80 ℃之间，表示单螺旋结构和无定形区的熔解，80～160 ℃内的第2个峰对应双螺旋结构和结晶区的熔解[11]。由表3可知，超声处理后两个峰的起始温度T0和峰值温度Tp几乎都先随处理时间的延长而升高，在处理30 min时分别达到最大值（35.88±0.32）℃和（55.45±0.97）℃，80～160 ℃内，超声处理30 minTp较对照组增大了11.09%，40～50 min时开始降低，最后低于CK。T0主要与淀粉粒的无定形区有关，而结晶区是影响Tp的主要因素，淀粉颗粒的致密化程度也对Tp有一定影响[26]。这说明一定时间的超声处理使淀粉颗粒的结构更加稳定致密，而T0和Tp的降低可能是由于淀粉颗粒破碎与双螺旋结构松动[27]。ΔH可用来表示淀粉相变过程中双螺旋解聚及熔融所需要的能量，超声处理后ΔH增大，这是因为超声作用增强了淀粉链中的氢键，增加了双螺旋的稳定性[27]。同时，淀粉结构的破坏促进了水分子在淀粉颗粒中的渗透，从而使淀粉更容易糊化，ΔH增大[28]。由表3可知，80～160 ℃内，超声处理30 min ΔH较对照组增大了89.21%，超声处理40、50 min时的ΔH均低于处理30 min的ΔH（972.01±4.46）J/g和（2 309.37±7.31）J/g，ΔH的降低可能是由于空化气泡坍塌释放的大量能量破坏了部分结晶区，还导致双螺旋解聚[29]。Hu Aijun等[27]在研究双频超声处理大米淀粉时也得到类似结果，但在处理马铃薯淀粉时结果相反。

表3 不同超声处理时间对LS热学特性的影响Table 3 Effect of different ultrasound treatment times on thermal properties of LS

2.4 超声处理时间对LS微观结构的影响

由图3可知，CK中淀粉颗粒以椭圆形和球形为主，表面光滑，超声处理后的LS表面出现孔洞，促进水向内渗透，使其具有较高的糊化黏度。随着超声处理时间的延长，淀粉颗粒表面变得更加粗糙，并出现额外的裂缝和凹陷。在处理40、50 min组中有部分淀粉颗粒表面在长时间的超声作用下由于空化气泡的快速形成和坍塌产生的强剪切力完全被破坏（图中圈画部分），淀粉颗粒的破坏削弱了淀粉分子间的相互作用，从而导致了淀粉糊网状结构的减弱[30]。此外，超声处理后部分破碎的淀粉颗粒可能为水的向内扩散提供额外的通道，从而改变LS的颗粒结构，因此淀粉的溶胀能力增强，这与在糊化性能测定中观察到的结果一致。

图3 不同超声处理时间对LS微观结构的影响Fig.3 Effect of different ultrasound treatment times on the microstructure of LS

2.5 超声处理时间对LS层状结构的影响

由图4A可知，LS在q＝0.626 nm-1处有一个明显的散射峰，根据Woolf-Bragg公式dBragg＝2π/q，可以计算淀粉颗粒半结晶片层的厚度[31]，结果如图4B所示。从图中可以看出，超声处理后LS的半结晶层厚度增大，且随着超声处理时间的延长先增大（10、20 min）后减小（30、40、50 min），最大值为10.508 nm。这可能是因为适当的超声处理时间促进非结晶区的膨胀，随着时间的延长，超声处理时产生的空化效应破坏了LS的部分无定形层和结晶片层，层状厚度随之减小。

图4 不同超声处理时间对LS层状结构的影响Fig.4 Effect of different ultrasound treatment times on the lamellar structure of LS

根据Power-Law模型I～q-α，当1＜α＜3，质量分形维数Dm＝α，Dm值越接近1，表明淀粉聚集体结构越疏松，越接近3表明越致密；当3＜α＜4，表面分形维数Ds＝6-α，Ds值越大表明散射体表面越粗糙[30]。从图4C可以看出，所有样品的α值都在2.22～2.80的范围内，说明都为质量分形结构。超声处理后，LS的Dm值均降低，表明超声处理使淀粉的结构变得疏松。这可能是由于超声处理过程中振荡和产生的剪切力影响了层状晶体层的有序度，从而降低了淀粉结构的致密性[13]。与超声处理20 min后的样品相比，处理30 min样品的α值增大，表明超声处理使得淀粉结构变得疏松，但是随着时间延长，在一定程度上又可以促进一些紧密结构的形成。但是当超声时间达到40 min和50 min后，淀粉的结构被破坏从而又变得疏松。

2.6 超声处理时间对LS结晶结构的影响

如图5A所示，CK在5.6°、15.0°、17.1°、23.0°、26.6°处出现特征衍射峰，说明LS符合B型结晶特征[5]，超声处理后未出现其他位置的衍射峰，说明在超声过程中并未生成新的结晶结构。超声处理后5.6°处衍射峰消失，而该处属于B型结晶的较强衍射峰之一，表明超声处理对其B型结晶结构造成了一定的破坏。17.1°处衍射峰减弱，表明超声破坏了淀粉无定形区中双螺旋的部分排列。随着处理时间的延长，23.0°处的衍射峰强度减弱，可能是因为长时间的超声进一步影响了淀粉簇在结晶区域的排列[32]。淀粉颗粒中存在着微晶结构、非晶态结构及介于之间的亚微晶结构，通过计算XRD图谱中峰面积得到上述3 种结构的占比。由图5B可知，超声处理后LS亚微晶区结晶度增大，微晶区和非结晶区结晶度减小，表明淀粉颗粒内部结构趋于均匀，晶体崩解重组为亚微晶。超声过程中，双螺旋结构由于空泡坍塌产生的振荡而出现松动，但不离开原有位置[33]，因此，微晶区域减少，而亚微晶区域增加，这可能导致ΔH升高。LS的相对结晶度随着超声处理时间的延长而降低，这可能归因于超声产生的空化作用破坏了支链淀粉的结晶层，导致相对结晶度下降[33]。

图5 不同超声处理时间对LS结晶结构的影响Fig.5 Effect of different ultrasound treatment times on the crystalline structure of LS

2.7 超声处理时间对LS短程有序结构的影响

如图6所示，超声处理后未出现新的吸收峰，各吸收峰位置也未改变，说明超声只影响了LS的物理结构，并未破坏其化学结构。研究表明，1 047、1 022 cm-1为典型的振动吸收峰区域，波数1 047 cm-1附近的吸收峰与淀粉的结晶结构有关，1 022 cm-1附近的吸收峰与无定形结构有关，因此两处吸收峰的比值可以表征淀粉短程有序结构，1 047 cm-1/1 022 cm-1处吸收峰比值越大，表明有序度越高[34]。如图6所示，超声处理后R1047/1022值增大，随着处理时间的延长而增大，在30 min时达到最大值，随后略有下降，但仍高于原淀粉，这是由于超声处理后无定形区和支链淀粉分子链被破坏，同时生成的短链分子链通过氢键形成新的有序结构，使R1047/1022值增加了3.20%，但处理时间过长会导致双螺旋结构和直链淀粉分子链断裂，从而使R1047/1022值降低。结合XRD的结果可知，超声处理能够促进淀粉分子排列成更有序的双螺旋结构，但会使双螺旋结构松动，降低致密性[34]。

图6 不同超声处理时间对LS短程有序结构的影响Fig.6 Effect of different ultrasound treatment times on the short-range ordered structure of LS

2.8 超声处理时间对LS糖苷键的影响

图7A为不同时间超声处理前后LS的1H NMR图。图中δ＝5.11和δ＝4.89处的化学位移分别代表了α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键结构，超声处理后，α-1,6-糖苷键吸收峰强度明显减弱，说明在超声处理过程中α-1,6-糖苷键被破坏。Yang Qingyu等[35]采用超声处理糯玉米淀粉也得到了相似的结果。根据谱图计算得到的DB如图7B所示，超声处理后LS的DB均减小，超声处理40 min时达到最小值9.55%，说明超声产生的强剪切力破坏了α-1,6-糖苷键[36]。超声处理50 min后淀粉的DB有所增加，这可能是因为随着时间的延长，超声开始破坏α-1,4-糖苷键，DB增大[37]。超声处理过程中，α-1,6-糖苷键较α-1,4-糖苷键更易被破坏，这是因为α-1,4-糖苷键的空间位阻比α-1,6-糖苷键的空间位阻更稳定[35]。

图7 不同超声处理时间对LS糖苷键的影响Fig.7 Effect of different ultrasound treatment times on the glycosidic bonds of LS

2.9 超声处理对LS理化和结构特性的影响机制探讨

图8为超声处理对LS理化和结构特性的影响机制示意图。在超声处理过程中，α-1,6-糖苷键被破坏（图7），机械作用产生的剪切力使LS的部分支链断裂，形成一些淀粉短链，这些分散在无定形区和结晶区域的短链取向重排，形成有序结构，淀粉分子有序化程度增加（图6B）。结晶结构被破坏，崩解重组为亚微晶结构，亚微晶区比例增加（图5B）。由于淀粉分子间相互作用的增强，淀粉的双螺旋结构变得有序和紧密，淀粉内部的缠结加剧。在无定形区和结晶区域熔化这种紧凑的双螺旋结构需要额外的能量，因此，Tp和ΔH增加。此外，淀粉表面出现的一些孔洞和凹陷促进了水分子进入无定形区，增加了淀粉的糊化黏度。当超声处理时间较长时，淀粉颗粒会被破坏，淀粉分子的溶胀和缠结减少，从而导致糊化黏度降低。在强烈的剪切力作用下，双螺旋结构松动，有序的单螺旋结构被破坏，Tp、ΔH降低。因此，在实际应用过程中，可以选择适合的超声时间从淀粉多尺度结构层面上调控LS的性能以提高其品质。

图8 超声处理对LS理化和结构特性的影响机制示意图Fig.8 Schematic diagram of the mechanism underlying the effect of ultrasound treatment on physicochemical and structural properties of LS

3 结论

超声处理时间对LS理化和结构特性有较大的影响。超声处理破坏了α-1,6-糖苷键，使部分支链淀粉断裂，形成淀粉短链，并在超声作用下重新排列形成有序的结构。较短时间的超声处理增强了淀粉间的相互作用，双螺旋结构变得有序和紧密，淀粉内部的缠结增强，从而提高了LS的黏弹性。在无定形区和结晶区熔化紧凑的双螺旋结构需要额外的能量，Tp和ΔH分别增大了11.09%和89.21%。此外，超声处理后的淀粉表面出现孔洞和裂缝，促进了水分子向无定形区的注入，从而增加了淀粉的糊化黏度。但长时间的超声处理（40～50 min）不利于这种有序结构的形成。本研究结果验证了超声技术调控和改善LS性能的可行性，并为超声技术应用于生产不同品质的淀粉提供了理论参考。