5 种氧化型减菌剂对罗非鱼片品质及蛋白质的影响

闫玉红，黄 卉，李来好，郝淑贤，陈胜军，岑剑伟，吴燕燕，魏 涯，相 欢

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；2.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州 510300）

罗非鱼（Oreochromis nilotica）是我国主要的养殖经济鱼类，以冻罗非鱼片出口销售为主，鲜活销售为辅[1]，若产品的初始菌落过高，在贮藏中易加速产品的腐败变质，因此加工过程中的减菌化处理显得尤为重要[2]。常用的减菌剂有H2O2溶液、NaClO溶液、ClO2溶液、臭氧水和微酸性电解水等，多为氧化型减菌剂，减菌处理的同时还存在鱼肉氧化的问题[3]。

目前对减菌化处理的研究多集中在减菌效果及减菌剂对产品感官、色泽和脂肪氧化等方面的影响[1,4-6]，蛋白质是鲜罗非鱼片中最主要的组成成分，肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）是肌肉组织的主要结构蛋白，约占蛋白质总量的50%～70%[4]，蛋白质的氧化会对鱼片的感官品质产生显著影响。钟智豪[7]使用臭氧和二氧化氯对草鱼进行减菌处理，研究表明其蛋白质氧化程度高于对照组；赵永强[8]、李文协[9]分别用臭氧水漂洗罗非鱼片和鲅鱼鱼糜，均得出臭氧等能促进肌肉蛋白质生化特性改变的结论。虽然已有关于减菌剂对鱼肉蛋白影响的研究，但多种减菌剂对蛋白质氧化的比较研究鲜有报道。本研究在考察各减菌剂减菌效果的同时，测定鱼片质构特性、色泽和MP氧化等指标的变化情况，阐释氧化型减菌剂对鱼肉蛋白质的影响；从微观角度揭示罗非鱼片减菌后品质变化的机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜罗非鱼（500±50）g 广州华润万家超市。

三羟甲基氨基甲烷（分析纯）酷尔化学科技（北京）有限公司；蛋白定量、羰基、巯基测试盒南京建成生物工程研究所；NuPAGETMBis-Tris预制胶（12%）、NuPAGETMMOPS十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）电泳缓冲液（20×）英潍捷基（上海）贸易有限公司；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）上样缓冲液、考马斯亮蓝染色液 上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1FD超净工作台 苏州净化设备有限公司；CR-400色彩色差 日本柯尼卡美能达控股公司；Sunrise-basic吸光酶标仪 瑞士Tecan公司；QTS-25质构仪美国CNS Farnel公司；3K30台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司；Mini Gel Tank蛋白电泳槽 美国Invitrogen公司；基础电泳仪 美国Bio-Rad公司；Cary Eclipse荧光分光光度计 美国Varian公司；微酸性电解水实验机烟台方心水处理设备有限公司；CFS 500臭氧水一体机北京山美水美环保高科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将鲜活罗非鱼击晕后宰杀、去皮，取背部肌肉，切成大小均匀的鱼片（10.0 cm×4.0 cm×0.5 cm），清洗干净，备用。

1.3.2 罗非鱼片的减菌处理

用H2O2溶液、ClO2溶液、NaClO溶液、臭氧水和微酸性电解水对罗非鱼片进行减菌处理，质量浓度和处理时间参考岑剑伟[1]、王萍[10]等的研究，以料液比1∶5浸泡罗非鱼片，对照组用无菌水浸泡5 min，各处理组作3 个平行[1]，取平均值。减菌剂的质量浓度和处理时间水平如表1所示。

1.3.3 菌落总数的测定

参照GB/T 4789.2—2022《食品微生物学检验 菌落总数测定》[11]进行。通过减菌实验获得最佳减菌处理结果后，进一步针对最佳条件下的鱼肉样品进行质构特性、色泽、蛋白质氧化等指标的检测分析。减菌率按式（1）计算：

1.3.4 质构特性的测定

参考熊雅雯等[12]的方法，并适当修改。采用QTS-25质构仪对不同减菌处理下的鱼片进行质构测定，每组取鱼片3 片，如图1所示，沿鱼片对角线在背部均匀选取5 个位置进行测试，取平均值。

图1 罗非鱼片质构测试点示意图Fig.1 Schematic diagram of the texture test points of tilapia fillets

1.3.5 色泽的测定

参考赵敏等[13]的方法，并适当修改。白肉色泽测定背中部，红肉色泽测定背部主脊部位，室温下使用色差计测定不同减菌处理下鱼片的L*、a*、b*值。

1.3.6 MP的提取和含量测定

MP的提取参考Pazos等[14]的方法并适当修改，采用Bradford法测定MP含量。

1.3.7 羰基、巯基和疏水性的测定

巯基、羰基含量利用总巯基含量、羰基含量测定试剂盒测定。

疏水性测定参考Lv Mingchun等[15]的方法，并适当修改。用50 mmol/L磷酸盐缓冲液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）将MP稀释至1 mg/mL，取200 μL 1 mg/mL的溴酚蓝溶液与1 mL MP混匀，1 mL缓冲液作为空白，涡旋振荡10 min，4 000 r/min、4 ℃离心15 min，取上清液稀释10 倍，在595 nm波长处测定OD值，以溴酚蓝结合量表征疏水性，按式（2）计算：

1.3.8 内源荧光光谱测定

参考Shi Jing等[16]的方法，并适当修改。用50 mmol/L磷酸盐缓冲液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）将MP稀释至1 mg/mL，滤膜过滤。以缓冲液作为空白，利用荧光分光光度计进行光谱扫描，激发波长295 nm、发射波长300～400 nm、波长扫描范围300～500 nm、激发和发射狭缝宽度均为5 nm。

1.3.9 圆二色光谱测定

参考李可等[17]的方法，并适当修改。用50 mmol/L磷酸盐缓冲液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）将MP稀释至0.5 mg/mL，取适量于1 mm比色皿并放入样品池内。圆二色光谱仪参数：响应时间0.5 s、扫描范围190～260 nm、扫描步阶1 nm、缝宽1 nm，摩尔椭圆率表示圆二色性，CDNN软件计算二级结构含量。

1.3.10 SDS-PAGE分析

参考Pan Chuang等[18]的方法，并适当修改。MP与SDS-PAGE上样缓冲液（5×）按3∶2（V/V）混合，沸水浴5 min，上样量为10 μg，使用12% SDS-PAGE分离胶，5%浓缩胶，电泳电压120 V，电泳时间约1 h。

1.4 数据处理

采用Excel软件进行数据处理；采用SPSS 26软件进行单因素方差分析，通过Duncan检验进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著；采用Origin 2021软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同减菌处理对鲜罗非鱼片菌落总数的影响

H2O2溶液杀菌机理是利用活性氧，破坏微生物体内组织，达到杀灭微生物的目的[5]。由图2a可知，使用质量浓度为500、1 000、1 500 mg/L的H2O2溶液处理罗非鱼片，减菌率随着溶液质量浓度增加而显著提高（P＜0.05），在500～1 000 mg/mL之间，减菌率增长迅速，处理时间0～5 min组减菌速率明显高于5～8 min组。原因可能有两方面：一是鱼片初始菌落数较大，前期杀菌速率较快，后期菌落总数基本稳定；一是H2O2溶液稳定性较低，受光照、放置时间等影响，分解为水和氧气，导致溶液质量浓度略有下降[6]。不同质量浓度的减菌溶液处理罗非鱼片，减菌率随着处理时间的延长和质量浓度的增大而增加，如图2a、3a所示，罗非鱼片在质量浓度1 500 mg/L溶液中浸泡处理8 min，处理当天减菌率达到80.1%，4 ℃真空包装贮存3 d的罗非鱼片减菌率依然保持80%以上。石红等[19]用1.27 g/L H2O2溶液浸泡染菌的虾仁2 min，减菌率可达89.66%。孙继英等[20]用0.7 g/L H2O2溶液处理鱿鱼6 min，减菌率可达97 %，比本实验减菌率略高，说明H2O2溶液能有效杀菌，减菌率与原料及初始菌落有关。

图2 5 种减菌剂对罗非鱼片处理当天的减菌效果Fig.2 Effect of five decontaminants on reducing bacterial load on tilapia fillets on the day of treatment

图3 5 种减菌剂对罗非鱼片处理后4 ℃真空包装贮存3 d的减菌效果Fig.3 Effect of five decontaminants on reducing bacterial load on tilapia fillets stored in vacuum at 4 ℃ for 3 days after treatment

ClO2溶液能氧化定位细胞表面的蛋白质，改变细胞膜的通透性，引起内容物外泄、细胞代谢紊乱，进而杀灭微生物[21]。由图2b可知，用质量浓度为100、150、200 mg/L ClO2溶液处理罗非鱼片，100～150 mg/mL处理0～10 min减菌率变化显著，150～200 mg/mL、10～15 min的处理条件下减菌率增长缓慢，由此可知，ClO2溶液一定浓度和时间范围内减菌率提升加快，但超出此范围，减菌率趋于稳定。原因可能是ClO2对光敏感，在光照下极易分解，浸泡后期溶液浓度下降[22]。如图2b、3b所示，罗非鱼片在质量浓度200 mg/L溶液中浸泡处理10 min，处理当天减菌率达到81.3%，4 ℃真空包装贮存3 d减菌率依旧能够保持80%以上。王萍等[10]用200 mg/L ClO2处理20 min军曹鱼片，减菌率达83%，与本实验减菌率接近。

NaClO溶液杀菌主要通过次氯酸分子作用、新生氧的氧化作用和氯化作用，破坏细胞内核酸和酶的结构，引起糖代谢失调，进而杀灭微生物[23]。由图2c可知，用质量浓度为100、150、200 mg/L的NaClO溶液处理罗非鱼片，处理时间在0～10 min减菌率变化显著，在10～15 min内减菌变化不明显，可能是NaClO溶液具有光敏性，见光后会迅速分解[24]。如图2c、3c所示，鱼片在质量浓度200 mg/L溶液中浸泡处理10 min，减菌率达到80.9%，4 ℃真空包装贮存3 d减菌率依旧能够保持80%以上。何丽等[25]用300 mg/L NaClO溶液浸泡处理草鱼鱼腩5 min后减菌率达83%，本实验减菌率与其接近。

臭氧水中具有较高反应活性的自由基，氧化破坏微生物的细胞器和DNA、RNA等重要组成部分，菌体细胞失去活力，微生物进而裂解死亡[26]。由图2d可知，用质量浓度为3、7、9 mg/L的臭氧水处理罗非鱼片，后期减菌速率明显低于前期，原因可能是臭氧极易挥发，溶液质量浓度随处理时间的延长逐渐降低[27]。如图2d、3d所示，鱼片在质量浓度9 mg/L溶液中浸泡处理10 min，减菌率达到81.7%，4 ℃真空包装贮存3 d减菌率依旧能够保持80%以上。钟智豪[7]在质量浓度为7 mg/L的臭氧水中流动浸泡草鱼片10 min，减菌率达68.28%，减菌率比本实验低，有可能是臭氧浓度偏低造成的。

微酸性电解水是近年来新兴的绿色杀菌技术，主要通过无隔膜的电解装置将稀盐酸溶液电解获得，其中次氯酸为主要杀菌成分[28]，有效氯质量浓度、pH 5.0～6.5和氧化还原电位是影响其杀菌效果的主要因素，三者共同作用通过攻击微生物细胞的多个靶点达到杀菌目的[29]。由图2e可知，用质量浓度为20、30、40 mg/L的微酸性电解水处理罗非鱼片，处理时间为0～10 min减菌率变化非常显著，在10～20 min内减菌变化不明显，可能是10 min处理对细菌的杀菌效率已达到比较高的水平，菌落总数基本稳定；也可能是微酸性电解水具有不稳定性，曝光放置一段时间逐渐还原为普通水[29]。如图2e、3e所示，鱼片在质量浓度30 mg/L溶液中浸泡处理20 min，减菌率达到80.21%，在质量浓度40 mg/L溶液中浸泡处理15 min，处理当天减菌率达到81.78%，4 ℃真空包装贮存3 d减菌率依旧能够保持80%以上，通过感官评价及质构分析得到鱼片在质量浓度30 mg/L的微酸性电解水中处理20 min品质较好。于福田[30]研究表明在35 mg/L的微酸性电解水中以料液比1∶6浸泡罗非鱼片22 min，减菌率可达到81.59%，本实验减菌率与其相似。

5 种减菌剂的减菌率达到80%的条件分别为1 500 mg/L H2O2溶液浸泡8 min；200 mg/L ClO2溶液浸泡10 min；200 mg/L NaClO溶液浸泡10 min；9 mg/L臭氧水浸泡10 min；30 mg/L微酸性电解水浸泡20 min。在此条件下减菌能力稳定，能保持菌落总数的相对稳定，可进一步研究减菌处理当天对鱼片质构、色泽和肌肉蛋白质的影响。

2.2 不同减菌处理对鲜罗非鱼片质构的影响

如表2所示，与对照组相比，处理组的硬度、弹性、内聚性、胶着性和咀嚼性都显著增加（P＜0.05），其中对质构特性影响最关键的指标：硬度变化最明显，变化幅度由大到小依次是NaClO溶液＞ClO2溶液＞臭氧水＞微酸性电解水＞H2O2溶液，原因可能是减菌处理使MP氧化，鱼肉表面的蛋白质变性失水，结构发生变化，产生交联聚集，造成咀嚼性和硬度的增加；各实验组浸泡时间并不相同，浸泡时间的长短对质构影响较大，于福田[30]研究发现微酸性电解水浸泡罗非鱼片20 min内，硬度变化不明显，超过20 min，硬度开始下降明显。赵永强[8]、颜明月[31]研究表明臭氧水处理罗非鱼片的硬度均高于对照组。刘慧[32]研究表明使用微酸性电解水处理罗非鱼片当天鱼肉硬度增大，与本实验结果相似，其他指标稍有上升，但是变化幅度较小。本实验结果表明，使用减菌剂处理鱼肉会导致鱼肉在处理当天硬度上升。

表2 不同减菌条件对罗非鱼片质构的影响Table 2 Effects of different decontaminants on the texture of tilapia fillets

2.3 不同减菌处理对鲜罗非鱼片色泽的影响

2.3.1 对白肉色泽的影响

如表3所示，与对照组相比，经减菌处理后鱼片白肉的L*值和b*值增大、a*值下降，其中L*值变化最显著（P＜0.05），这说明减菌剂处理存在漂白情况。L*值变化幅度由大到小依次为微酸性电解水溶液＞ClO2溶液＞臭氧水＞NaClO溶液＞H2O2溶液，原因可能是氧化型减菌剂能够氧化发色团，生成不含发色团或者不吸收可见光的发色团的物质[33]；各实验组浸泡时间并不相同，浸泡时间的长短对色泽影响较大，微酸性电解水浸泡20 min，漂白效果最明显，L*值最高。杨运懿[34]用双氧水浸泡白鲢鱼糜能够提高凝胶的白度；钟智豪[7]在研究草鱼减菌过程中发现臭氧组和二氧化氯组白度优于对照组；刘慧[32]在研究微酸性电解水对草鱼杀菌效果的过程中发现，处理组的白度值显著高于对照组（P＜0.05），本实验结果与其相似。

表3 不同减菌条件对罗非鱼片白肉色泽的影响Table 3 Effects of different decontaminants on the color of white meat in tilapia fillets

2.3.2 对红肉色泽的影响

如表4所示，与对照组相比，经减菌处理后脊部红肉鱼片的L*值增大，a*和b*值下降，其a*值变化最显著（P＜0.05），变化幅度由大到小依次为臭氧水＞ClO2溶液＞NaClO溶液＞微酸性电解水＞H2O2溶液，主要原因是ClO2溶液、NaClO溶液以及微酸性电解水中的氯不稳定，容易得到2 个电子变成-1价稳定结构；臭氧水、H2O2溶液分解释放出氧，具有较强的氧化性，增加了鱼肉表面的氧分压，使肌红蛋白、血红蛋白以及其他一些呈色蛋白变性，生成其他衍生物，改变鱼肉色泽[34-35]。李杉等[36]采用几种减菌剂对罗非鱼背部主脊部位进行处理，发现a*值都有不同程度的下降。李蓓蓓等[37]研究表明ClO2处理鲈鱼鱼肉和鱼鳃a*值均下降，王萍等[10]研究表明使用多种减菌剂处理后军曹鱼片的a*值均低于对照组，本实验结果与其一致。

表4 不同减菌条件对罗非鱼片红肉色泽的影响Table 4 Effects of different decontaminants on the color of red meat in tilapia fillets

2.4 可溶性MP含量、羰基、巯基、疏水性的变化

由表5可知，罗非鱼肉经减菌处理后MP和总巯基含量下降，表面疏水性和羰基含量上升。与对照组对比，处理组的MP质量浓度变化明显（P＜0.05），可能是氧化作用导致组织微观结构遭到破坏，蛋白质降解为小分子蛋白。MP质量浓度从大到小依次为对照组＞H2O2溶液＞臭氧水＞ClO2溶液＞NaClO溶液＞微酸性电解水溶液，可以看出罗非鱼肉在30 mg/mL微酸性电解水处理20 min时，MP质量浓度变化最明显，与对照组相比下降了12.8%。

表5 不同减菌条件对罗非鱼片MP含量、羰基、巯基、疏水性的影响Table 5 Effects of different detontaminants on MP content and carbonyl and sulfhydryl group contents and hydrophobicity of MP in tilapia fillets

蛋白质的部分侧链氨基酸易氧化成羰基衍生物，因此，羰基含量可作为衡量蛋白质氧化程度的敏感指标[38]。减菌处理组与对照组相比，罗非鱼片MP羰基含量显著增加（P＜0.05），羰基含量从大到小依次为NaClO溶液＞微酸性电解水溶液＞H2O2溶液＞臭氧水＞ClO2溶液＞对照组。这可能是减菌剂氧化攻击蛋白质，形成新的以碳为中心的自由基，引发蛋白质自由基链反应，产生了大量的羰基[39]。

巯基是鱼肉蛋白中最具活性的功能基团。蛋白质氧化可使巯基转化成二硫键，故巯基含量可以反映蛋白质氧化程度[40]。减菌处理对罗非鱼肉蛋白的巯基有显著影响（P＜0.05），减菌剂处理组总巯基含量低于空白对照组，总巯基含量从大到小依次为对照组＞ClO2溶液＞臭氧水＞H2O2溶液＞NaClO溶液＞微酸性电解水溶液。原因可能是减菌处理后游离巯基被氧化，导致游离巯基含量降低；也可能是氧化导致蛋白聚集体的形成，部分巯基被覆盖，检测到的游离巯基数量减少[41]。

蛋白质氧化导致肽链断裂，氨基酸疏水基团暴露，表面疏水性与氧化程度成正比[42]，因此疏水性可以反映蛋白质氧化程度。减菌处理对罗非鱼肉蛋白的疏水性有显著影响（P＜0.05），疏水性从大到小依次为NaClO溶液＞微酸性电解水溶液＞臭氧水＞ClO2溶液＞H2O2溶液＞对照组。这可能是部分氨基酸的结构在减菌剂处理过程中被氧化，疏水性基团暴露在蛋白质表面，加快溴酚蓝与蛋白质的结合，使表面疏水性增加[43-44]。

2.5 内源荧光光谱分析

内源荧光光谱通过反映蛋白质中色氨酸等荧光基团的氧化程度及所处环境的变化，以表征氧化对蛋白结构和构象的影响[45]。如图4所示，295 nm激发波长下MP在334 nm波长处具有最高的荧光强度，不同减菌处理后的蛋白荧光强度有不同程度的降低，与初始值相比，臭氧水、H2O2溶液、ClO2溶液、NaClO溶液、微酸性电解水处理组荧光强度比初始值分别下降了8.54%、13.37%、14.61%、19.44%、34.76%。强度下降原因是鱼肉在减菌处理中MP结构因氧化作用逐渐展开，侧链荧光氨基酸的氧化暴露[16]。最大荧光位置出现红移现象，说明减菌处理后被包埋的色氨酸残基处在更加极性的环境[46]，蛋白内部疏水性氨基酸暴露在表面，疏水性增加，与上述疏水性结论一致。

图4 不同减菌处理对罗非鱼片MP荧光光谱的影响Fig.4 Effects of different decontaminant treatments on the fluorescence spectrum of MP in tilapia fillets

2.6 圆二色光谱分析

由图5可知，MP在208 nm和222 nm波长处出现两个负峰，是α-螺旋结构的特征吸收峰[47]，摩尔椭圆度的绝对值与α-螺旋含量呈正比。与对照组相比，减菌处理后MP的椭圆度绝对值明显减小，尤其是微酸性电解水处理的变化最明显，表明α-螺旋含量最低。如图6所示，处理组MP二级结构性能均有所下降，α-螺旋相对含量呈下降趋势，β-折叠相对含量呈上升趋势，β-转角相对含量略有下降，无规卷曲相对含量略有增加，与对照组相比，臭氧水、H2O2溶液、ClO2溶液、NaClO溶液、微酸性电解水处理组α-螺旋结构相对含量比初始值分别下降了4.74%、6.84%、7.89%、11.58%、16.84%。这说明氧化对蛋白质二级结构产生影响，α-螺旋转化成的β-折叠和无规卷曲结构，蛋白质二级结构从有序向无序转变[48]。

图6 不同减菌处理对罗非鱼MP二级结构的影响Fig 6 Effects of different decontaminant treatments on the secondary structure of MP in tilapia fillets

2.7 SDS-PAGE分析

MP中包含肌球蛋白重链（200、100 kDa）、肌动蛋白（43 kDa）、原肌球蛋白（35 kDa）以及肌球蛋白轻链（16～25 kDa）等成分[49]。罗非鱼片经过不同氧化型减菌剂处理后，MP的降解情况如图7所示，经过NaClO溶液、臭氧水和微酸性电解水减菌处理后，肌球蛋白重链、肌动蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白轻链都发生了不同程度的降解，其中微酸性电解水处理组蛋白条带变化最明显，这可能是氧化作用导致肽链断裂，蛋白质降解和其他小分子化合物降解[50]。H2O2处理组和ClO2处理组的肌动蛋白和原肌球蛋白条带强度增强，这可能是减菌处理产生的氧化条件导致蛋白质的空间结构改变，蛋白质可能发生交联，产生高分子质量化合物，促进了蛋白质的交联聚集[51]。

图7 不同减菌处理下罗非鱼片MP的SDS-PAGE图谱Fig.7 SDS-PAGE profiles of MP in tilapia fillets subjected to different decontaminant treatments

3 结论

本研究对比了5 种氧化型减菌剂对罗非鱼片的减菌效果，减菌率达80%的减菌条件为：1 500 mg/L H2O2溶液浸泡8 min，减菌率达到80.1%；200 mg/L ClO2溶液浸泡10 min，减菌率达到81.3%；200 mg/L NaClO溶液浸泡10 min，减菌率达到80.9%；9 mg/L臭氧水浸泡10 min，减菌率达到81.7%；30 mg/L微酸性电解水浸泡20 min，减菌率达到80.21%。在此条件下对色泽、质构特性、蛋白氧化指标进行测定，氧化型减菌处理后鱼肉MP发生不同程度的氧化，鱼片硬度增大；L*值增大，a*值减小；MP质量浓度、总巯基含量均下降，羰基含量升高，表面疏水性基团数量增加；α-螺旋转化更为舒展的β-折叠和无规卷曲结构；荧光氨基酸氧化和暴露，MP发生不同程度的降解。在减菌率都达到80%的条件下，5 种减菌剂的氧化能力中微酸性电解水最强，其次是NaClO溶液。蛋白结构和功能性的改变会严重影响鱼类制品的品质特性、营养价值和加工性能，工厂通常采用减菌剂杀菌后封装保存，残留的氧化型减菌剂会造成持续性氧化，因此，从提升产品品质上考虑，未来可寻找合适的抗氧化剂减轻后续氧化型减菌剂对鱼肉蛋白产生的影响。