富硒豌豆苗粉理化性质及抗氧化活性分析

王智伟，李 茜,2,*，张 民,2,3,*

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300392；2.天农农产品加工中外联合研究中心，天津 300392；3.天津科技大学 食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457）

硒元素是人体所必需的重要微量元素之一，其在抗氧化[1]、防癌抗癌[2-5]、免疫调节[6-7]、预防心血管疾病等[8-9]诸多方面均能够起到一定的积极作用[10]。我国是世界上主要的硒资源国之一，但也存在硒资源分布不均衡的情况，世界卫生组织对健康成人的硒推荐摄入量为55 μg/d，而我国大部分地区人口平均硒摄入量为26.00～32.00 μg/d，处于缺硒状态[11]，因此，通过食用富硒食品对于人体进行科学有效地补硒十分重要[12]。自然界中的硒元素主要以无机硒和有机硒两种形式存在，无机硒包括硒单质、硒（亚硒）酸盐等形式，有机硒包括硒蛋白（多肽）、硒多糖、硒核酸等形式。无机硒的毒性较大，可使用剂量范围较窄，而有机硒因具有吸收率和生物活性高、安全性强、环境污染小等优点，目前已成为健康型营养补充剂的研究热点之一。将植物性食物富集的有机硒作为膳食补充剂是一种改善中国居民膳食含硒量不足且同时避免硒中毒的较理想方式。

借助于蔬菜粉水分含量低、贮存时间长、应用范围广等优势，将富硒豌豆苗加工为富硒豌豆苗蔬菜粉，既可以改善蔬菜产品的营养学特性，又可以减少蔬菜浪费，具有广阔的开发应用前景[13-14]。基于此，本实验探讨不同干燥方式下富硒豌豆苗粉的理化性质及体外抗氧化活性，旨在为有机硒天然食品补充剂开发及富硒食品产业化提供一定的理论指导与技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豌豆购于山东水生田园旗舰店；富硒豌豆苗、富硒豌豆苗粉由天津农学院实验室提供（豌豆苗粉中总硒含量2.0 μg/g）。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力试剂盒、羟自由基测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、Tris-HCl、邻苯三酚（均为分析纯）天津百奥泰科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

Mars6微波消解仪 深圳CEM仪器公司；HWS-28恒温水浴锅 天津欧诺仪器仪表有限公司；FL970荧光分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；LGR20-W高速离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；TU-1810分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 富硒豌豆苗粉的制备

取一定量富硒豌豆苗，自来水清洗干净，90 ℃热烫5 min，取出沥干，切分成均匀规格，分别探采用不同方式对富硒豌豆苗进行干燥。未富硒豌豆苗进行相同处理。

1.3.1.1 豌豆苗粉的热风干燥

将上述切分好的豌豆苗样品分别置于60、80、100、120、140 ℃温度条件下进行热风干燥，物料干燥至含水率为5%时粉碎，得到经热风干燥制备的富硒豌豆苗粉，测定有机硒含量，以干燥前的样品有机硒含量（以干基计）为对照，计算有机硒含量损失率，选取热风干燥最优的加工工艺参数[15]。

1.3.1.2 豌豆苗粉的冷冻干燥

将上述切分好的豌豆苗样品置于-35 ℃环境中冷冻过夜后，置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，物料干燥至含水率为5%时粉碎，得到经冷冻干燥制备的富硒豌豆苗粉，并进行豌豆苗蔬菜粉有机硒含量的测定，以干燥前的样品有机硒含量（以干基计）为对照，计算有机硒损失率，并与热风干燥最优工艺下的数据进行对比分析。

1.3.2 有机硒含量的测定

富硒豌豆苗粉有机硒含量的测定采用王世成等[16]的方法并稍作修改。称取1.0 g豌豆苗粉样品置于离心管内，加入9 mL蒸馏水，搅拌混匀，随后4 500 r/min离心20 min，重复进行5 次，收集沉淀，按照GB 5009.93—2017《食品中硒的测定》的相关方法进行微波消解后，采用荧光分光光度法测得有机硒的含量。

1.3.3 豌豆苗粉色差的测定

干燥后的富硒豌豆苗粉样品置于比色皿中，采用色差仪测定不同干燥条件下所得豌豆苗粉的色差参数，其中L*值表示亮度，a*值表示红绿度，b*值表示黄蓝度。

1.3.4 豌豆苗粉微观结构观察

采用扫描电镜观测豌豆苗粉的表观形貌。分别取适量未富硒、富硒的豌豆苗粉样品，置于扫描电镜的样品台上进行喷金镀膜处理（厚度10～20 mm、10 kV、15 mA），处理好的豌豆苗粉置于扫描电镜观察台，调节扫描电镜的焦距，分别在×300、×600、×1 000放大倍数下对豌豆苗粉样品进行表观形貌的观察。

1.3.5 豌豆苗粉水分分布的测定

称取豌豆苗粉样品50.0 mg置于核磁管中，采用低场核磁共振分析仪的脉冲序列对样品中水分分布的横向弛豫时间（T2）进行测定。测定条件：采样带宽200、射频延时0.002 s、重复采样等待时间1 000 ms、回波时间0.2 ms、重复采样64 次、回波个数3 000。在采样信号曲线所得到的弛豫谱图中，弛豫峰面积比例代表该相态水含量，峰面积越大表示该相态的水含量越多。

1.3.6 豌豆苗蔬菜粉复水性的测定

复水性的测定采用问小龙等[15]的方法。准确称取0.25 g豌豆苗粉，加入5 mL蒸馏水，在室温条件下静置1 h，10 000 r/min条件下离心25 min，收集沉淀物称质量，以沉淀的质量计作复水后豌豆苗粉的质量。以复水比表征复水性，复水比按公式（1）计算：

式中：mv为复水后蔬菜粉的质量/g；md为复水前蔬菜粉的质量/g。

1.3.7 体外抗氧化活性的测定

称取未富硒、富硒豌豆苗粉样品各0.2 g，置于50 mL的离心管中，分别加入10 mL体积分数80%乙醇溶液，利用超声波仪（功率480 W）提取20 min，过滤除去残渣，即得到抗氧化物质的乙醇提取液，配制成不同质量浓度（0.325、0.650、1.300、2.600、5.200 mg/mL）的样品溶液，于-4 ℃密封保存、备用[17]。

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力的测定

采用DPPH自由基试剂盒法测定样品的DPPH自由基清除能力，以未富硒豌豆苗粉乙醇提取液为阴性对照，VC标准品溶液为阳性对照。取上述豌豆苗粉醇提液400 μL，加入600 μL工作液混匀，在室温25 ℃条件下避光静置30 min，4 000 r/min离心5 min，吸取溶液800 μL至比色皿中，用无水乙醇调零，在517 nm波长处测定吸光度。按公式（2）计算DPPH自由基清除率：

式中：A空白为无水乙醇＋工作液组的吸光度；A对照为无水乙醇＋样品组的吸光度；A测定为工作液＋样品组的吸光度。

1.3.7.2 羟自由基清除能力的测定

采用羟自由基试剂盒法测定样品的羟自由基清除能力，以未富硒豌豆苗粉乙醇提取液为阴性对照，VC标准品溶液为阳性对照。配制好的底物应用液置于37 ℃水预中预温3 min，取0.2 mL底物应用液加入0.2 mL豌豆苗粉乙醇提取液、0.4 mL应用液III，迅速混匀，37 ℃水浴反应1 min后，立即加入定量显色剂终止反应。将溶液混匀，室温放置20 min后，用蒸馏水调零，在550 nm波长处测定吸光度。按公式（3）计算羟自由基清除率：

式中：A空白为以蒸馏水替代样品溶液组的吸光度；A对照为以蒸馏水替代应用液组的吸光度；A测定为应用液＋样品组的吸光度。

1.3.7.3 超氧阴离子自由基清除能力的测定

样品中超氧阴离子自由基清除能力的测定也以未富硒豌豆苗粉乙醇提取液为阴性对照，VC标准品溶液为阳性对照。取0.05 mol/L Tris-HCl溶液4.5 mL置于试管中，37 ℃静置水浴30 min后，加入1.0 mL豌豆苗粉乙醇提取液和0.5 mL 25.0 mmol/L邻苯三酚溶液，置于25 ℃水浴环境中反应4 min，加入8.0 mol/L HCl溶液0.5 mL，在320 nm波长处测定吸光度[18]，以蒸馏水调零。按公式（4）计算超氧阴离子自由基清除率：

式中：A0为以蒸馏水替代样品溶液组的吸光度；A2为添加邻苯三酚样品溶液组的吸光度；A1为未添加邻苯三酚样品溶液组的吸光度。

1.3.7.4 还原力的测定

取1.0 mL质量浓度为0.65 mg/mL未富硒与富硒豌豆苗粉的乙醇提取液于试管中，分别加入pH 6.6的磷酸盐缓冲溶液2.0 mL，之后加入质量分数1.0%的铁氰化钾溶液2.5 mL并充分混匀，50 ℃水浴20 min。取出后放置到室温状态，持续添加体积分数10.0%的三氯乙酸溶液2.5 mL。待其加入完成后，3 000 r/min离心10 min。取样品上层醇提液2.5 mL，加入同体积的蒸馏水混合均匀，再加入0.5 mL体积分数0.1%三氯化铁溶液，置于室温环境下避光反应10 min，于700 nm波长处测定吸光度[19]。

1.4 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 不同干燥方式对富硒豌豆苗粉中有机硒含量的影响

由图1可以看出，经热风干燥工艺处理后，富硒豌豆苗粉的有机硒有所损失。热风干燥的温度较高时，虽然豌豆苗样品干燥成粉所需的时间较短，但其有机硒损失较高；热风干燥的温度较低时，有机硒损失程度则较低，但豌豆苗样品干燥成粉所需的时间较长。综合考虑，选取热风干燥工艺的温度为100 ℃，此条件下有机硒含量最高，为1.05 μg/g，损失率最低，为36.7%。

图1 不同干燥方式对富硒豆苗粉有机硒含量及损失率的影响Fig.1 Effects of drying methods on organic selenium content and loss percentage of pea seedling powder

经冷冻干燥处理得到的富硒豌豆苗粉有机硒含量为1.15 μg/g，有机硒损失率为33.8%，其有机硒损失率略低于热风干燥方式处理得到的豌豆苗粉，但均差异不显著。综合考虑实际生产过程中成本投入、能耗等问题，选择100 ℃热风干燥工艺获得的富硒豌豆苗粉进行后续分析。

2.2 热风干燥温度对富硒豌豆苗粉色泽的影响

L*值可衡量产品色彩的明暗程度，其值越大表示样品表面越亮；a*值可衡量产品的红绿程度，正值表示偏红色，负值表示偏绿色，b*值可衡量产品的蓝黄程度，其为正值表示偏黄色，负值表示偏蓝色[20]。由图2可知，不同热风干燥温度之间L*值具有显著差异（P＜0.05）。a*值越小表明样品色泽则越鲜绿，热风干燥温度为60～100 ℃时，a*值为负值，表明豌豆苗粉在较低温度下干燥时，对原料本身的鲜绿度影响较小；温度高于120 ℃时，a*值较大，表明其颜色偏黄，这可能与干燥过程中的美拉德反应有关，热风干燥温度越高，褐变越严重。各组间b*值存在显著差异（P＜0.05），富硒豌豆苗粉整体色泽偏向黄色。这可能与硒元素的富集有关，硒元素本身的颜色为红色，豌豆苗颜色呈绿色，当两者叠加时可能会呈现黄色[21]。当干燥温度为100 ℃时，富硒豌豆苗粉的色泽较为明亮、鲜绿，其L*值为45.98，a*值为-4.83，b*值为21.17。

图2 热风干燥温度对富硒豌豆苗粉色泽的影响Fig.2 Effect of hot air drying temperature on the color of seleniumenriched pea seedling powder

2.3 富硒对豌豆苗粉表观形貌的影响

由图3可知，未富硒与富硒的豌豆苗粉表观形貌均呈现块状颗粒，表面褶皱；与未富硒豌豆苗粉相比，富硒的豌豆苗粉表面未观察到明显的孔洞，但表面褶皱程度及纤维管束明显增多，这一点在豌豆苗复水过程中有助于增加与水分的接触面积或增强毛细管吸附作用中有所体现，因此有利于豌豆苗粉复溶过程中保持较好的吸水性、持水性或膨胀度，同时也说明富硒能对豌豆苗粉表观形貌具有一定的影响[22]。

图3 富硒与未富硒豌豆苗粉扫描电镜观察结果Fig.3 SEM images of selenium-enriched and ordinary pea seedling powders

2.4 富硒对豌豆苗粉水分分布的影响

低场-核磁共振图中，T21、T22和T23处的峰分别代表紧密结合水、弱结合水（机械结合水）和自由水的弛豫时间，数值越高代表水分的流动性越高；A21、A22和A23分别为T21、T22和T23的各自峰面积所占峰面积之和的百分比，其数值越高代表此部分水分的比例越大[23]。对于豌豆苗粉体系，T21代表的紧密结合水存在于非水组分附近，与其分子之间通过化学键紧密结合的一部分水，而蛋白、糖水化合物等聚合物分子链的膨胀、伸展及持水网络结构是大分子与水分子通过紧密缔合形成的；因此，此部分水分的含量可能对体系复溶过程中分子链的膨胀、伸展及持水网络结构形成具有重要影响；T22代表机械结合的水分，为分子表面附着的水，具有一定的流动性，这部分水分的存在有助于稳定大分子结构；T23代表自由水，此部分水分为干燥过程中去除的主要水分，因此，此部分水分的含量可能与干燥程度有关[24-25]。由图4和表1可知，与未富硒豌豆苗粉相比，富硒豌豆苗粉紧密结合水（A21）及机械结合水（A22）的比例显著增加，且机械结合水的流动性显著增强；富硒豌豆苗粉自由水比例显著减少，说明富硒豌豆苗粉在干燥过程中可以更好地除去游离水分。这可能是富硒过程中硒元素与豌豆苗细胞结合，导致其渗透压增大，从而改变了豌豆苗粉的水分分布情况。这一点也有利于改善产品的贮藏稳定性及加工适应性，例如冷藏过程中减少冰晶的形成，以及复水过程中保持较好的复溶性。

表1 富硒对豌豆苗粉T2和峰值面积的影响Table 1 Effect of selenium enrichment on T2 relaxation times and peak area ratios in pea seedling powder

2.5 富硒对豌豆苗粉复水性的影响

复水性对蔬菜粉品质有重要影响，由图5可知，富硒豆苗粉的复水性显著高于未富硒豆苗粉，这可能是由于富硒改变了豌豆苗粉的细胞渗透压或纤维结构[26-27]。这与上述表观形貌、水分分布的分析结果相印证。

图5 富硒对豌豆苗粉复水性的影响Fig.5 Effect of selenium enrichment on rehydration ratio of pea seedling powder

2.6 富硒对豌豆苗粉的体外抗氧化活性的影响

富硒过程中，硒元素可以通过与豌豆苗粉某些活性物质的结合从而改变体系的抗氧化活性及功能特性等[28]。例如，硒元素与豆苗蔬菜粉中谷胱甘肽过氧化物酶的结合可提高其DPPH自由基清除能力[29-31]，硒蛋白以及一些含硒的酶类物质能够有效清除羟自由基[32]，以硒元素为活性部位的蛋白物质可提高其超氧阴离子自由基清除能力。

由图6及表2可以看出，0～6 mg/mL范围内，未富硒与富硒豌豆苗粉乙醇提取液均表现出DPPH自由基、羟自由基及超氧阴离子自由基的清除能力，但均低于VC的清除效果，且随质量浓度增加，各自由基的清除能力呈现先增加后趋于平缓的趋势。与未富硒豌豆苗粉相比，质量浓度相同时，富硒豌豆苗粉乙醇提取液DPPH自由基、羟自由基及超氧阴离子自由基的清除率显著较高（P＜0.05）。根据半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）和还原力，判定富硒豌豆苗粉乙醇提取液DPPH自由基清除能力（IC50＝0.61 mg/mL）、羟自由基清除能力（IC50＝0.86 mg/mL）及超氧阴离子自由基清除能力（IC50＝0.90 mg/mL）较未富硒豌豆苗粉乙醇提取液显著提高（P＜0.01）。这可能与富硒过程中，硒元素与某些氨基酸、谷胱甘肽过氧化物酶等物质的结合有关。胡玲玲等[33]在富硒发芽糙米蛋白抗氧化活性研究中的相关结果也表明硒元素可能会与某些酶类物质结合，从而提高其抗氧化活性；赵萍等[34]所进行的小麦发芽富硒工艺及抗氧化活性研究也同样表明硒元素可提高其抗氧化活性。但体外抗氧化实验易存在假阳性结论，因此还需进一步通过动物或细胞实验明确富硒豌豆苗粉的生物活性机制。

表2 豌豆苗粉乙醇提取液体外抗氧化活性的IC50Table 2 IC50 for in vitro antioxidant activity of ethanol extract from pea seedling powder

图6 豌豆苗粉乙醇提取液的体外抗氧化活性Fig.6 In vitro antioxidant activity of ethanol extract from pea seedling powder

某种物质其提供的电子能力越强，所具有的还原力就越强，本实验所选择的实验试剂为铁氰化钾，其测定的吸光度越大，被检测物质的还原力则越强，抗氧化能力越高[35]。由图6可知，富硒豌豆苗粉醇提液的铁离子还原能力显著高于未富硒豌豆苗粉乙醇提取液（0.30 vs.0.17，P＜0.01），这可能是因为含硒元素的物质有效抑制了金属离子的催化氧化作用[36]。

3 结论

本实验以未富硒豌豆苗粉和富硒豌豆苗粉为研究对象，在建立了豌豆苗粉热风干燥工艺的基础上，系统探究了富硒过程对豌豆苗粉理化性质及体外抗氧化活性的影响规律。结果表明，豌豆苗粉热风干燥过程中，当干燥温度为100 ℃时，富硒豌豆苗粉的品质较为理想，有机硒损失率较小（36.7%）；其L*值为45.98，a*值为-4.83，b*值为21.17，色泽较为明亮、鲜绿；豌豆苗粉表观形貌呈现块状颗粒，表面褶皱程度且纤维管束明显增多；与未富硒豌豆苗粉相比，富硒豌豆苗粉中紧密结合水、机械结合水比例显著增加，自由水比例显著较少（P＜0.01）；与未富硒豌豆苗粉乙醇提取液相比，经富硒后的豌豆苗粉乙醇提取液在DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除能力以及铁离子还原能力方面具有显著提升，富硒豌豆苗粉的体外抗氧化能力显著高于未富硒豌豆苗粉（P＜0.05），说明富硒可在不影响豆苗蔬菜粉理化特性的基础上显著增强其体外抗氧化活性。