UPLC-HRMS法同时直接测定白酒中多种痕量呈香呈味物质及衍生物含量

杨军林，尹艳艳，尹延顺，杨少娟，田栋伟，谢 丹，尤小龙，吴 成，胡建锋，张德芹

（贵州习酒股份有限公司，贵州 遵义 564622）

白酒风味是决定其品质的重要因素，目前主要针对白酒中挥发性香气物质的研究较多[1-3]。但白酒作为固态发酵蒸馏的产物，同样存在某些非挥发性物质[4-5]。据文献报道，非挥发性物质的存在对于白酒的风格特征同样产生重要作用，它作为潜在的重要呈香呈味物质，构成了白酒口感的丰富性和复杂性；可与挥发性物质产生相互作用，调节挥发性物质的挥发性能，改变并协调白酒的香气结构，如调节放香强度与香气持久性；非挥发性物质还具有独特和重要的生物活性功能和效果[4-7]。

有机酸类物质是白酒的重要风味物质，其中有机酸的种类和含量不仅影响白酒发酵过程微生物的生长与繁殖，也影响酯类香气物质的合成。作为白酒中重要呈香呈味物质，起着呈香、助香、减少刺激和缓冲平衡的作用，其含量及组成直接影响着白酒的风味、品质及饮后舒适度[8-9]。在白酒生产中关注较多的是难挥发性有机酸，且以乳酸为主的比例及其量化关系研究较多，研究方法通常为气相色谱或气相色谱-质谱联用技术[10-11]；同样，其他难挥发性有机酸也不易气化，并且即使进行酯化衍生处理，有些也无法被有效解析[12]。因此，现阶段主要采用高效液相色谱法及离子色谱法进行白酒中难挥发性有机酸的定性定量分析。

白酒中氨基酸主要来源于酿酒原料中蛋白质酶降解、发酵过程中微生物的代谢及其发酵后微生物细胞自溶[13-14]。氨基酸对葡萄酒品质有重要影响[15]，它也是黄酒中重要的营养成分和风味前驱体[16-18]，同样，白酒中氨基酸及其衍生物作为风味前体物质可能对其呈香呈味有重要影响[13]。其中，饮料酒中杂醇油主要是发酵过程中氨基酸脱氨基和脱羰基代谢产生，如正丙醇来自于苏氨酸、异丁醇来自于缬氨酸、异戊醇来自于亮氨酸、2-苯乙醇来自于苯丙氨酸等。其次，在饮料酒发酵过程中氨基酸还与多种含氮化合物的形成相关，如吡嗪类化合物杂环氮原子来自α-氨基酸[19-20]。此外，白酒中生物胺与氨基酸也有一定联系[21]，生物胺作为一类含氮的脂肪族、芳香族或杂环类化合物，主要通过氨基酸的脱羧、醛与酮的胺化及转氨基作用产生，对动植物和微生物活性细胞有重要的生理作用，适量生物胺有助于机体正常的生理功能，但过量会引起血压升高、头痛、皮疹等不良生理反应，有时则表现为胃肠功能紊乱，如出现呕吐和腹泻，并伴随腹痛等症状[22-24]。此外，有研究表明白酒中吡咯烷约占总生物胺含量的50%以上，可能是其沸点接近白酒蒸馏温度而进入酒体中造成的，并且吡咯烷是一种白酒中特有而其他酒类中没有或含量很低的生物胺[25]。

目前，针对白酒中氨基酸多采用氨基酸自动分析仪以及柱前衍生-液相色谱仪检测[26-27]，而对于白酒中难挥发性有机酸则主要通过高效液相色谱法及离子色谱法测定[28-30]，国内外研究人员开发了测定白酒中多种呈香呈味物质的检测方法[4-5,8-9]，但针对白酒中多种痕量呈香呈味物质以及生物胺同时进行定性定量分析的检测方法甚少。因此，本实验通过超高效液相色谱-高分辨质谱仪建立一种同时测定白酒中多种痕量呈香呈味物质及衍生物含量的检测方法，对白酒样品中某些非挥发性物质进行准确定性定量分析，以期为后续推进白酒中的非挥发性物质组成及其量比关系对提高白酒品质研究提供数据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售白酒购于贵州遵义习水县合力超市。

甲醇 德国Merck公司；甲酸 美国Thermo Fisher Scientific公司；15 种氨基酸混标（2.5 mmol/LL-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸以及1.25 mmol/LL-胱氨酸）和L-瓜氨酸（98.0%）德国Merck公司；2,3-二羟基丙酸（96.03%）上海麦克林生化科技有限公司；β-苯乙胺（98.6%）、酪胺（98.9%）、吡咯烷（98.5%）德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；L-色氨酸（99.04%）、色胺（98.4%）、L-酒石酸（99.2%）、L-苹果酸（99.8%）、没食子酸（99.1%）、阿魏酸（99.9%）、儿茶素（99.7%）、咖啡酸（99.4%）、木犀草素（98.6%）、绿原酸（99.4%）、对香豆酸（99.9%）、柠檬酸（98.9%）标准品 上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-高分辨质谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；QT-1旋涡混合器 上海琪特分析仪器有限公司；HC-3518高速离心机 安徽中科中佳科学仪器公司；Raykol AUTO EVA氮吹仪 睿科集团（厦门）股份有限公司；AR2140万分之一分析天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；艾科普超纯水机美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

准确量取适量样品于离心管中，经10 000 r/min高速离心10 min后直接过0.22 μm水系PES针筒式过滤膜于2.0 mL液相色谱进样小瓶中，待上机分析。

1.3.2 超高效液相色谱分析

超高效液相色谱仪条件：选用Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）色谱柱；采用0.1%甲酸溶液（A）和甲醇（B）为流动相，按表1程序梯度洗脱；柱温为40 ℃，进样量为2 μL，流速0.2 mL/min，分析时间为16 min。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

高分辨质谱仪离子源条件：加热电喷雾电离源；鞘气流量：40 arb；辅助气流量：10 arb；喷雾电压：±3.2 kV；离子源温度：350 ℃；毛细管温度：320 ℃。

高分辨质谱仪扫描条件：采用全扫描/数据依赖性二级扫描的正负离子同时扫描采集模式；一级扫描范围为m/z50.0～400.0；一级扫描分辨率70 000；自动增益控制进入轨道阱中的离子数（AGC target）为106；最大注入时间30 ms；二级扫描分辨率：17 500；AGC target为5×104；最大注入时间50 ms；归一化碰撞能量：10、20、30 eV。

各待测组分化合物信息及高分辨质谱参数见表2，采用外标法定量，仪器采集数据的定性定量分析采用Xcalibur 4.1软件。

表2 各待测组分化合物信息及高分辨质谱参数Table 2 Information about and HRMS parameters for all analytes

1.3.3 待测组分标准溶液配制

各待测组分标准储备液配制：将17 种氨基酸、4 种生物胺以及11 种难挥发性有机酸待测组分按照类别分别用超纯水配制成浓度为100 μmol/L（L-胱氨酸为50 μmol/L）、5.0 μg/mL和10.0 μg/mL的混合标准储备液，贮存于4 ℃备用；

待测组分混合标准工作系列溶液配制：以超纯水为试剂，配制成不同浓度氨基酸系列标准溶液（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 μmol/L）、不同质量浓度生物胺系列标准溶液（2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L）以及不同质量浓度难挥发性有机酸系列标准溶液（10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 μg/L）。

1.4 数据处理与分析

用Xcalibur 4.1软件处理数据，以待测组分标准工作溶液系列浓度为横坐标（X），相应待测组分色谱峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，拟合得到相关线性回归方程；将白酒样品经上述前处理之后通过超高效液相色谱-高分辨质谱仪分析，利用待测组分标准工作曲线计算，即得到白酒样品中各待测组分的含量。每个实验指标至少重复3 次。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

采用直接高速离心后过膜与经氮吹除乙醇后上机分析的两种前处理方式，测定白酒中的木犀草素、β-苯乙胺和L-苏氨酸，从而明确适用于分析白酒样品中多组分的前处理方法。如图1A所示，与先氮吹除乙醇的前处理方式相比，直接经高速离心膜过滤处理后的木犀草素色谱峰响应值明显较高；同时，经添加木犀草素标准溶液的氮吹除乙醇样品中其色谱峰响应值低于未添加标准溶液样品，结果表明，氮吹除乙醇前处理方式不利于白酒样品中木犀草素含量的测定，对检测结果有不利影响；如图1B所示，两种前处理方式对添加标准溶液样品中β-苯乙胺的色谱峰响应值影响差异不明显；如图1C所示，4 种样品中L-苏氨酸色谱峰响应值差异不明显。因此，通过不采用氮吹除乙醇消除乙醇的干扰，仅采取高速离心后过膜处理即可实现白酒样品中多种待测组分的检测。

图1 氮吹除乙醇样品与直接离心后过膜样品处理方式下待测组分色谱图Fig.1 Chromatographic profiles of analytes in samples subjected to nitrogen blowing for ethanol removal or direct centrifugation and membrane filtration

2.2 仪器参数的优化

2.2.1 色谱柱对检测结果的影响

本实验考察了Hypersil Gold C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）、Accucore aQ（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）3 种液相色谱柱对白酒样品中32 种待测组分的分离效果影响，结果如图2所示。以柠檬酸为例，样品经前处理后上机分析发现Hypersil Gold C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）与Accucore aQ（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）色谱柱分离柠檬酸色谱峰宽度较大，且出现了明显的拖尾现象；但经Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）色谱柱分离柠檬酸的色谱峰明显优于其他2 种色谱柱。因此，采用Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）色谱柱作为分析色谱柱，可实现白酒样品中多组分的检测。

图2 不同液相色谱柱下待测组分色谱图Fig.2 Chromatographic profiles of analytes in samples separatedon different liquid chromatographic columns

2.2.2 流动相洗脱体系对检测结果的影响

考察了0.1%甲酸-甲醇、1 mmol/L乙酸铵（0.1%甲酸）-甲醇两种流动相洗脱体系对测定32 种待测组分的分离效果影响。如图3所示，以吡咯烷为例，0.1%甲酸-甲醇流动相洗脱体系的吡咯烷色谱峰响应值明显高于1 mmol/L乙酸铵（0.1%甲酸）-甲醇流动相洗脱体系。因此，采用0.1%甲酸-甲醇流动相洗脱体系可以较好实现白酒样品中32 种组分的分离。

图3 不同流动相洗脱下待测组分色谱图Fig.3 Chromatographic profiles of analytes in samples separated using different mobile phases

2.2.3 梯度洗脱程序对待测组分分离的影响

采用表3不同梯度洗脱程序参数考察不同梯度洗脱程序下待测组分分离情况。如图4所示，以吡咯烷为例，洗脱程序1的吡咯烷色谱峰响应值明显高于洗脱程序2，同时，洗脱程序3的吡咯烷色谱峰保留时间早于洗脱程序1，表明吡咯烷在洗脱程序3下尚未完全保留于液相色谱柱内而被流动相洗脱。因此，采用梯度洗脱程序1可以较好实现白酒样品中32 种组分的分离。

图4 不同流动相洗脱程序条件下待测组分吡咯烷的色谱对比Fig.4 Chromatographic profiles of pyrrolidine under different mobile phase elution procedures

表3 不同梯度洗脱程序参数Table 3 Parameters of different gradient elution procedures

2.2.4 分子离子峰对待测组分分析的影响

考察了2 种分子离子峰（[M＋H]＋和[M＋H]-形式）对待测组分分析的影响，白酒样品经高速离心后过膜处理，再利用超高效液相色谱-高分辨质谱仪进行分析。通过不同待测组分的分子离子峰响应值得出，17 种氨基酸和4 种生物胺的分子离子峰在[M＋H]＋形式下响应值最高，11 种难挥发性有机酸的分子离子峰在[M＋H]-形式下响应值最高（图5），各待测组分化合物信息及高分辨质谱参数详见表2。

图5 32 种待测组分的分子离子提取色谱图Fig.5 Extracted ion chromatograms of 32 analytes in samples

2.3 各待测组分检测方法的线性范围和检出限（limit of detection，LOD）及定量限（limit of quantitation，LOQ）

各待测组分混合标准工作系列溶液在上述条件下进行测定，采用外标法定量。以各待测组分的浓度为横坐标（X）、定量离子的色谱峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，即得相关线性回归方程；以信噪比为3计算得到各待测组分的LOD，以信噪比为10计算得到LOQ。如表4所示，待测组分标准标准曲线的线性关系良好（R2＞0.990），且各待测组分的LOD、LOQ相对较低，可满足后续白酒中待测组分的定量分析以及低含量组分的测定。

表4 各待测组分标准工作系列溶液的线性方程、LOD和LOQTable 4 Linear equations,detection limits and quantification limits of all analytes

2.4 各待测组分测定方法的回收率和精密度

在基质样品中根据各待测组分的LOQ，加入3 个不同浓度的待测组分标准溶液，使其配制成加标样品，按上述方法进行前处理，利用超高效液相色谱-高分辨质谱仪进行分析，每个加标水平做3 次平行，每个平行重复测定6 次，计算平均回收率，以验证测定方法的准确度、精密度及稳定性，分析结果见表5。对于3 种不同的加标水平，其平均回收率在71.92%～117.45%范围内，且相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在0.46%～5.48%之间。可见，该测定方法对白酒样品中多种痕量呈香呈味物质及其衍生物具有良好的回收率、精密度及稳定性，同时，前处理方法对样品中各待测组分损失较低。

表5 各待测组分测定方法的回收率和精密度Table 5 Recoveries and precision for all analytes

3 讨论与结论

检测白酒样品中多组分的方法中，大多数会采取氮吹或者其他方式去除乙醇对检测结果的干扰，达到更好的检测效果[31]，但本研究发现对白酒样品的前处理方法有氮吹或者其他方式除乙醇步骤，这会对白酒样品中的痕量呈香呈味物质检测造成不同程度的影响，而当不进行氮吹或者其他方式除乙醇，直接对白酒样品进行高速离心、膜过滤时，却可以更好地实现白酒样品中多种痕量呈香呈味物质的检测分析。同时，采用该方法可实现定性定量分析白酒样品中多种痕量呈香呈味物质，进而结合滋味稀释技术的分析方法，准确且高效地鉴定出白酒样品中关键性呈香呈味物质[8,12]，这为进一步解析不同类型白酒样品的风味成分构成提供了数据支撑。

本方法前处理过程简单易操作，无需除去样品中多余乙醇含量，也不用使用有机溶剂进行液液萃取处理，样品仅需高速离心后过滤上机分析，同时，仪器分析过程仅需16 min便可完成一个白酒样品中待测组分的含量测定，故前处理实验成本低且低毒环保。该测定方法针对待测多组分化合物的线性关系良好，即R2＞0.990；同时各组分化合物LOQ低，即可满足实际白酒样品的相关化合物分析需求。其次，该方法准确性高和检测能力强，通过采用高灵敏度、高分辨率和强抗干扰能力的超高效液相色谱-高分辨质谱仪可对白酒中多种痕量呈香呈味物质及衍生物精确定量。该方法适合任何白酒样品中待测组分的定性定量分析，且样品实验用量少和分析时间短，可有效实现白酒中多种痕量呈香呈味物质的定性定量解析，能更好诠释其对白酒香气形成的贡献情况。