膜分离对福建产不同茶类提取物化学组成和抗氧化活性的影响

林清霞，王丽丽，宋振硕，蔡淑娴，刘仲华,*，陈 林,*

（1.福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福州 350013；2.湖南农业大学园艺学院，湖南 长沙 410128）

福建是中国著名的产茶大省，主产茶类有绿茶、白茶、乌龙茶（闽南乌龙、闽北乌龙）和红茶[1]。茶叶富含多酚、氨基酸、咖啡碱（caffeine，CAF）等代谢产物[2]，不同茶类的代谢产物存在较大差异，并因其内含组成不同赋予其不同的活性功能[3]。膜分离是20世纪60年代迅速发展起来的技术[4]，它依据不同的截留分子质量，可实现茶叶不同组分的分离、纯化和浓缩，并且无相变发生、无有机溶剂污染、能耗低、易实现规模化生产，在提取分离茶叶的功效成分方面具有广阔的应用前景，是当今分离学科中最重要的手段之一[5]。膜分离技术包括微滤、超滤、纳滤、反渗透等，其中超滤技术已开展应用于茶叶活性物质的分离富集。研究表明，膜分离技术已用于分离富集茶多酚（tea polyphenols，TPs）[6]、CAF[7]、茶多糖[8]、茶氨酸[9]、茶皂素[10]等茶叶功能成分以及茶饮料产业[11]，在茶叶精深加工方面具有广阔的发展应用前景。超滤技术目前用于茶叶功效成分的分离和富集大多聚焦于单一茶类、单级膜分离靶标产品的澄清、得率、纯度研究，不同茶类在多级膜分离过程中其功效成分及抗氧化活性变化尚缺乏系统性的研究[12-13]。因此，为了阐明不同茶类的生化成分及其体外抗氧化活性在不同膜分离过程的变化情况，本实验结合前期课题组研究基础，以绿茶、白茶、乌龙茶（闽南乌龙、闽北乌龙）和红茶4 种茶为原料，通过多级膜分离制备不同分子质量区间的茶粉样品，探究各茶粉的紫外光谱特征、主要生化成分变化情况及体外抗氧化活性变化情况。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同类别茶叶样本共计15 个，绿茶3 个、白茶3 个、闽南乌龙茶3 个、闽北乌龙茶3 个、红茶3 个。

福林-酚、茚三酮（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；儿茶素类及没食子酸标准品（纯度＞98%）美国Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（纯度＞97%）、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ）、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）（纯度均＞98%）合肥博美生物科技有限责任公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

HWS-28型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；膜分离系统（BONA-GM-19型反渗透膜小型试验机、超滤膜元件（聚醚砜树脂材质，长度30 cm，直径5 cm，过滤面积0.4 m2，选用截留分子质量20、10、3.5 kDa））山东博纳生物科技集团有限公司；B-290型喷雾干燥机 瑞士Büchi公司；Varioskan LUX多功能酶标仪 美国Thermo Scientific公司；1260型高效液相色谱系统（配备G1311CVL四元泵、G1329B标准自动进样器、G1316A柱温箱、G1315DVL二极管阵列检测器）美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

茶样按料液比1∶25（g/mL）加入沸水，100 ℃浸提20 min，10 min振摇1 次，趁热抽滤，浸提2 次，合并过滤液备用[14]。15 个样品均进行相同操作，每个茶样重复3 次工艺流程。即取500 mL过滤液直接喷雾干燥获得茶叶粗提物，剩余的过滤液通过反渗透实验分离机进行膜分离，将茶叶粗提物分为5 个不同部分。膜分离过程：首先经过20 kDa超滤膜在0.1 MPa压力条件下截留分离，收集截留液作为＞20 kDa茶叶提取物；透过液再次由10 kDa超滤膜分离，收集截留液作为10～20 kDa茶叶提取物；透过液再次经3.5 kDa超滤膜分离，收集截留液作为3.5～10 kDa茶叶提取物，收集透过液作为＜3.5 kDa茶叶提取物，分别经喷雾干燥后，制得各部分的膜分离茶粉。样品制作工艺流程如图1所示，其中闽北乌龙茶和红茶经20 kDa超滤膜分离后，大部分内含物质被截留，20 kDa透过液部分的内含物质浓度太低，最终闽北乌龙茶收集到4 个部分的茶粉，红茶收集到3 个部分的茶粉。

1.3.2 光谱获取

将质量浓度为200 μg/mL的茶粉水溶液加到96 孔板中，每孔加样量200 μL，采用酶标仪扫描200～450 nm波长范围的光谱，以超纯水作参比。

1.3.3 茶粉主要生化成分检测

TPs含量参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[15]中的福林-酚比色法测定；游离氨基酸（free amino acids，FAAs）含量参照GB/T 8314—2013《茶游离氨基酸总量的测定》[16]中的茚三酮比色法测定；CAF、没食子酸（gallic acid，GA）及儿茶素组分含量参照文献[17]中的方法测定。

1.3.4 茶粉体外抗氧化活性测定

分别精密称取100 mg茶粉，用超纯水定容至10 mL作为母液备用，用超纯水将母液稀释至20 μg/mL测定。分别取2 mL上述溶液于试管中，按文献[18]方法加入0.3 mmol/L DPPH自由基溶液2 mL，测定各茶粉的DPPH自由基清除能力。

用超纯水将10 mg/mL的茶粉母液稀释至200 μg/mL，以Trolox系列梯度浓度绘制标准曲线，铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）以茶粉中Trolox物质的量计（单位为mmol/g）[18]。

T-AOC采用试剂盒检测，10 mg/mL的母液用超纯水稀释至200 μg/mL测定。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 不同茶粉的紫外光谱表征

茶叶中多种水溶性成分均有特定的紫外吸收光谱，如多酚及其氧化产物、茶氨酸、茶多糖、嘌呤碱等[19-22]。从图2可以看出，各茶粉样品的紫外吸收光谱变化较为相似，在210 nm和274 nm波长处均有2 个较为明显的吸收峰。图2A～E分别为各茶类不同膜分离茶粉在同一质量浓度的紫外吸收光谱。不同膜分离部分在274 nm波长处的吸光度各有差异，不同茶类变化幅度不一致，这是因为茶粉中的成分配比不同，影响其在274 nm波长处的紫外吸光度。闽北乌龙在274 nm波长处的紫外吸光度变化幅度最大，红茶变化最小。这可能是由于膜分离过程各茶粉样品化学成分较为相近，但各化学成分间的配比发生改变。图2F为不同质量浓度（50、100、150、200、250 μg/mL）茶粉（闽南乌龙茶）水溶液的紫外吸收光谱，茶粉水溶液浓度与274 nm波长处的吸光度间存在良好线性关系。图2G为各茶类不同膜分离茶粉的紫外吸收光谱，不同茶类的膜分离样品其紫外光谱可以实现较好的区分，可采用紫外光谱鉴别不同来源的茶叶。

图2 不同茶粉样品的紫外光谱Fig.2 UV absorption spectra of membrane ultrafiltration fractions from tea aqueous extracts

2.2 不同茶粉的主要生化成分含量

2.2.1 不同茶粉的TPs、FAAs、CAF含量

TPs、FAAs、CAF是茶叶的主要呈味物质，TPs还是茶叶发挥抗氧化作用的主要活性成分，因此，考察三者的含量对评价茶叶的品质具有重要意义[23]。由图3A～C可以看出，不同茶类的TPs、FAAs、CAF含量均有差异；绿茶的TPs含量显著高于其他茶类，白茶、闽南乌龙、闽北乌龙差异不显著，红茶TPs含量最低；白茶FAAs含量显著高于其他茶类，绿茶和红茶FAAs含量差异不显著，仅次于白茶，闽北乌龙FAAs总量最低，闽南乌龙次之；闽南乌龙CAF含量显著低于其他茶类。各茶类样品的TPs含量分布均较为集中，白茶和红茶的FAAs含量分布较为离散，绿茶、白茶、闽南乌龙的CAF含量分布较为集中，而闽北乌龙和红茶的CAF含量分布离散。从图3D～F可看出，第3部分茶粉的TPs、FAAs、CAF含量均显著高于第1部分和第2部分；第3部分的TPs含量显著高于第4、5、6部分，而FAAs和CAF含量无显著差异。这说明各类茶的TPs、FAAs、CAF在20 kDa超滤膜透过液部分富集，后续进一步的膜分离对各类茶粉的FAAs和CAF无富集效果，且多酚含量略有降低。从整体看，不同膜分离部分TPs含量分布最为集中，而FAAs含量分布最为离散，即膜分离对各茶粉的FAAs含量影响较大；从局部看，第1部分和第2部分的TPs、FAAs、CAF含量分布均较为集中，而第3部分各成分分布均较为离散，即20 kDa超滤膜对各成分的分布情况影响较大。综上所述，茶类和膜分离过程均对各成分含量有影响，经20 kDa超滤膜分离后再经其他孔径超滤膜分离，其TPs、FAAs、CAF含量均无显著差异，各茶类经20 kDa膜进行单级分离即可。

图3 不同茶粉样的主要化学成分含量Fig.3 Contents of major chemical components in membrane ultrafiltration fractions from tea aqueous extracts

2.2.2 不同茶粉的儿茶素组分和GA含量

儿茶素类是T P s 的主体成分，占多酚类总量的60%～80%，它主要包括表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表儿茶素（epicatechin，EC）[3]。由图4A可以看出，不同茶类的GA以及各儿茶素含量均有差异。总体来看，茶叶中的EGC和EGCG含量高于EC和ECG含量，其中，EGC含量最高的是闽南乌龙茶，EGCG和ECG含量最高是绿茶，绿茶和闽南乌龙的EC含量相近，均处于较高水平。红茶中的EGC、EGCG、EC、ECG含量均处于较低水平。闽北乌龙茶和红茶中的GA含量最高，白茶和绿茶中的GA含量相近，闽南乌龙茶中的GA含量最低。由图4B～F可以看出，除红茶外，其他茶类各超滤膜分离部分的EGC、EGCG、EC、ECG含量变化趋势基本一致，均是第3部分含量高于第1、2部分；第3部分含量高于第4、5、6部分或第3、4、5、6部分差异不大；各部分的点分布均较为离散，EGC和EGCG的含量变化幅度最大。闽北乌龙茶和红茶的GA含量较高，且均是第3部分的GA含量高于第1、2部分；其他茶类的GA含量均比较低。由图4G可知，闽南乌龙中儿茶素总量（total catechin，TC）/TPs占比最高，绿茶、白茶次之，红茶最低，这与文献[24]报道不完全一致，这可能是由于TC/TPs占比在膜分离过程中发生改变，并且不同茶类的变化行为有所差异。由图4H可知，第3部分的TC/TPs占比高于前2 个部分，第4、5、6部分的TC/TPs占比均处于较高值，这说明膜分离可以提高TC/TPs占比。

图4 不同茶粉样的GA和儿茶素组分含量Fig.4 GA and catechin contents in membrane ultrafiltration fractions from tea aqueous extracts

2.3 不同茶粉的体外抗氧化活性分析

茶叶具有多种保健功效，尤以抗氧化活性成为众多学者关注的焦点[25]，金亮等[26]研究表明抗炎、抗衰老等功效均与抗氧化活性有很大的相关性。由图5A1、B1、C1可知，DPPH自由基清除能力、FRAP、T-AOC这3 种抗氧化能力的变化趋势基本一致，绿茶的抗氧化活性显著高于其他茶类，闽南乌龙茶、闽北乌龙茶和红茶的抗氧化活性依次降低，而白茶的DPPH自由基清除能力和T-AOC低于闽南乌龙，这与前人研究结果[27]不完全一致，这主要是由于茶叶抗氧化活性高低与茶叶中的活性成分含量及其配比密切相关[28]，膜分离过程各生化成分的含量发生改变，各成分间的配比也发生改变，并且膜分离过程中不同茶类生化成分含量变化幅度各不相同。从图5A2、B2、C2可知，第3部分的DPPH自由基清除能力、FRAP及T-AOC显著高于第2部分，而第3、4、5、6部分无显著差异，即20 kDa膜分离可显著提高茶粉的抗氧化活性；与单级膜分离相比，多级膜分离不会进一步提高茶粉的抗氧化活性。第3部分的点分布最为离散，结合图5A1、B1、C1可知，这几类茶中，红茶经20 kDa超滤膜分离后，其抗氧化活性变化幅度最大。红茶20 kDa超滤膜截留液部分抗氧化活性最高，其余茶类20 kDa超滤膜透过液部分抗氧化活性最高。

图5 不同茶粉的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of membrane ultrafiltration fractions from tea aqueous extracts

由图6可知，绿茶、白茶、闽南乌龙茶不同膜分离部分茶粉的DPPH自由基清除能力、FRAP、T-AOC这3 种抗氧化活性的变化趋势基本一致，第3部分的抗氧化活性显著高于第2部分，第4、5、6部分的抗氧化活性显著低于第3部分，闽北乌龙茶第3部分的抗氧化活性显著高于第2部分和第4部分。即绿茶、白茶、闽南乌龙茶、闽南乌龙茶在20 kDa超滤膜透过液部分抗氧化活性最高。红茶的第2部分抗氧化活性显著高于第3部分，即红茶的20 kDa截留液部分抗氧化活性最高。

图6 各茶类不同膜分离部分的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of membrane ultrafiltration fractions from tea aqueous extracts

2.4 相关性分析

由表1可知，274 nm波长处的吸光度与茶叶中多种成分呈极显著相关。相关性分析显示，274 nm波长处的吸光度与FAAs、CAF、GA、ECG含量均呈极显著正相关，与EGC含量呈极显著负相关，与EC含量呈显著负相关。课题组前期采用偏最小二乘回归模型建立了一种茶叶中咖啡因含量的紫外吸收光谱检测方法[29]，实现了茶叶中咖啡因含量的高通量、快速检测。后期可通过合理的数据处理方法进行回归建模，建立茶叶多组分与紫外吸收光谱的关系。

表1 茶叶中主要化学成分与紫外吸光度的关系Table 1 Correlation coefficients between chemical components and UV absorbance of membrane ultrafiltration fractions from tea aqueous extracts

由表2可知，DPPH自由基清除率、FRAP、T-AOC与TPs、EGC、EGCG、EC、ECG含量均呈极显著正相关，这说明在茶叶抗氧化成分中，TPs及其衍生产物是影响抗氧化活性的重要因素，这与文献[30]报道结果一致。GA含量与DPPH自由基清除率、FRAP、T-AOC均呈现显著负相关，这与文献[31]报道结果不一致，这主要是在抗氧化活性方面，TPs在量效上占据主导地位，总酚含量对抗氧化活性有决定性作用，其他成分含量的变化不能主导抗氧化活性的改变。如绿茶中的多酚含量高，GA含量低；红茶中多酚含量低，GA含量高；然而绿茶的抗氧化能力显著高于红茶；则最终显示GA与DPPH自由基清除率、FRAP、T-AOC呈显著负相关性，实际上GA本身具有抗氧化活性。

表2 茶叶中主要化学成分与抗氧化能力的关系Table 2 Correlation coefficients between chemical composition and antioxidant activity of membrane ultrafiltration fractions from tea aqueous extracts

3 结论

膜分离过程会影响茶叶的理化性质，不同茶类在膜分离过程中其理化性质变化行为不完全一致。以不同膜分离茶粉为基准，不同茶类的TPs含量排序为绿茶＞闽南乌龙茶＞白茶＞闽北乌龙茶＞红茶；不同茶类的FAAs含量排序为白茶＞红茶＞绿茶＞闽南乌龙茶＞闽北乌龙茶；不同茶类的CAF含量排序为红茶＞闽北乌龙茶＞白茶＞绿茶＞闽南乌龙茶。DPPH自由基清除率、FRAP、T-AOC的变化趋势基本一致，与TPs、EGC、EGCG、EC、ECG含量均呈极显著正相关。不同茶类的GA以及各儿茶素含量均有差异，茶叶经膜分离后各部分的儿茶素组分和GA含量的点分布均较为离散，尤以EGC和EGCG的含量变化幅度最大，膜分离可以提高TC/TPs占比。该研究结果在茶叶精深加工中的推广具有重要参考价值，尤其是在具体料液体系，特定的目标物、膜的筛选等方面提供重要理论支撑。各茶粉样品水溶液均有特定的紫外吸收光谱，今后可以重点开展以下几个方面的深入研究：系统考察ECG、EGC、EC、Arg、His、Asp、Glu、GA、CAF、茶氨酸等单一组分、多组分以及茶叶提取物复杂组分的紫外吸收光谱特征，进一步阐明茶叶组分与紫外吸收光谱的关系。