黄芪-莪术-重楼配伍激活PERK/eIF2α/ATF4信号通路介导抑制结直肠癌生长转移作用研究

张慧兰,郭文晖,苏婷婷,陈思,余倩慧,殷启航,万林鹭,王旭,唐德才

(南京中医药大学中医学院,江苏 南京 210023)

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是目前世界上确诊率排名第三、死亡率第二的癌症,其复发和转移是中晚期CRC患者死亡的重要原因[1-3]。肿瘤转移具有多步骤、低效率的特点,上皮细胞-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤出现侵袭、转移的关键环节,在这个过程中肿瘤细胞会发生遗传学及表观遗传学改变,使其适应转移过程中所面临的不利微环境,而后肿瘤细胞内发生持久稳定而程度适中的内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ER stress),未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)被持续激活。此时,机体处于“虚、瘀、毒”状态,肿瘤细胞得以增殖、生长,最终形成转移灶[4-6]。

中医学认为结直肠癌的发生发展离不开“虚、瘀、毒”三个方面,机体自虚-邪气侵入-癌毒流注是中医理论下肿瘤发生发展的动态演变过程,中医药在肿瘤治疗中发挥出显著优势。课题组针对结肠癌病机特点,自拟芪术抗癌方,将其主药黄芪-莪术-重楼(以下简称“芪-术-蚤”)组成小复方,构成“复合相使角药配伍”。角药配伍,发轫于《黄帝内经》“一君二臣,奇之制也”[7],三足鼎立,互成犄角。在“芪-术-蚤”角药配伍抗肿瘤应用研究中发现,治疗乳腺癌的“芪术蚤复方”[8]、原发性肝癌的“益气化瘀解毒方”[9]、恶性肿瘤骨转移的“扶正抑癌汤”[10]、晚期转移性结肠癌的“健脾消癌方”[11]以及“抗癌防移片”[12]等诸多含“芪-术-蚤”的抗肿瘤复方均能显著抑制肿瘤的复发转移率,提高生存率。“芪-术-蚤”是在中药配伍理论基础上,以辨证论治为前提,根据中药的性味、功效等将3味中药联合使用、系统配伍,补泻同施、寒温并用,共奏补气、活血、解毒之功,改善机体“虚、瘀、毒”状态,抑制结直肠癌生长、转移。

课题组前期采用网络药理学、理论研究及实验验证[13-15]等方法,证实芪-术-蚤角药配伍可通过降低内皮血管通透性[16]、肿瘤侵袭性伪足的形成及成熟[17]等机制,多通路、多靶点抑制CT26.WT细胞增殖、侵袭,抑制结肠癌CT26.WT细胞原位移植瘤生长、转移。本实验研究芪-术-蚤角药配伍在通过干预ER stress相关信号通路PERK/eIF2α/ATF4及机体氧化应激介导EMT中的作用,对芪-术-蚤角药配伍抑制肿瘤转移机制进行探讨,为抗结直肠癌生长、转移提供理论基础。

1 材料

1.1 试验药物

中药黄芪、莪术、重楼均购自江苏省中医院,经南京中医药大学药学院陆兔林教授鉴定,分别为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao的干燥根,姜科植物温郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根茎,百合科植物云南重楼ParispolyphyllaSmith var.yunanensis(Franch.) Hand.-Mazz.的干燥根茎。称取黄芪60 g,莪术30 g,重楼45 g,用10倍量超纯水浸泡0.5 h,加热回流提取1 h,重复2次,同步回收挥发油,合并2次滤液,用旋蒸仪浓缩后加入挥发油,制得生药量浓度约为1 g·mL-1的水煎液,4 ℃保存备用。

1.2 动物、细胞

实验动物选用BALB/c雄性小鼠30只,体质量(20±2)g,由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供,许可证号:SYXK(苏)2018-0049,饲养于南京中医药大学动物实验中心SPF级屏障环境中,分笼适应性饲养1周后进行实验。研究所涉及的实验动物研究内容和研究方案,均经南京中医药大学实验动物伦理委员会审查合格并批准,批准号:202203A030。

结肠癌细胞株CT26(CT26.WT,BALB/c鼠源)由北京市肿瘤防治研究所提供,培养条件:含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1链霉素的RMPI-1640培养基,恒温培养箱的条件设置为37 ℃,5% CO2。

1.3 试剂

DMEM培养基(Gibco,批号:C11995500BT),胎牛血清(FBS,Gibco,批号:10100147),0.25%胰酶消化液(Gibco,批号:T1300),磷酸盐缓冲液(PBS,南京伟沃生物,批号:P1022),青链霉素溶液(碧云天,批号:C0224-100m),Histoacryl医用组织胶水(德国B.Braun,批号:1050052),注射用5-氟尿嘧啶(5-FU,美国Sigma,批号:709D021),吸入性麻醉剂异氟烷(深圳瑞沃德,批号:R510-22-10),细胞培养瓶(美国康宁),RMPI-1640培养基(美国Sigma-Aldrich,批号:R8758),PERK抗体[SANTA(B-5),批号:sc-377400];p-PERK(Th980)抗体(Bioss,批号:bs-3330R);eIF2α抗体[SANTA(D-3),批号:sc-133132];p-IF2α(ser51)抗体(Affinity,批号:AF3087);ATF4抗体[SANTA(B-3),批号:sc-390063];Vimentin抗体(CST,批号:#3932S);E-Cadherin抗体(CST,批号:#3195S);N-Cadherin抗体(CST,批号:#4061S);Snail抗体(Abmart,批号:ab31787);Goat Anti-Rabbit IgG-HRP(Abmart,批号:M21002);SOD(睿信生物,批号:RX201865M);GSH-Px(睿信生物,批号:RX201049M);MDA(睿信生物,批号:RXJ203032M)。

1.4 仪器

超净工作台(苏州净化,SW-CJ-2FD),细胞培养箱(Thermo, Formaseries Ⅱ water jacke),高速冷冻离心机(Thermo Fisher,ST8R),电子分析天平(Sartorius,Quintix65-1CN),超纯水系统(Merck Millpore,BJ000842),蒸汽灭菌锅(ALP,CL-32L),组织包埋机(Leica,EG1150),转轮切片机(Leica,RM2255),摊片机、烤片机(Leica,HI1220),小动物吸入式气体麻醉机(瑞沃德,R500IE),数显游标卡尺(得力,DL91150),倒置显微镜(Leica,DFC-259),旋转蒸发器(上海亚荣,RE-2000B)。

2 方法

2.1 分组及给药

雄性BALB/c小鼠30只,适应性饲养1周后,造模术后分组,给药时间和给药方式分组见表1,阳性药组小鼠使用临床传统抗癌药物5-FU,芪-术-蚤组小鼠给药剂量根据课题组前期研究基础及临床用药习惯确定黄芪、莪术、重楼的用药比例为4∶2∶3,并参考南京中医药大学附属医院肿瘤科2021年临床中药处方剂量统计结果(见图1),确定芪-术-蚤用药剂量分别为20、10、15 g,通过人和动物体表面积折算的等效剂量比率表折算,给药期间每日称质量、观察各组小鼠的毛发、精神、活动度、饮食、大小便等情况,并进行记录。

图1 2021年1月—12月南京中医药大学附属医院肿瘤科临床中药处方重楼剂量统计Fig.1 Dosage statistics of clinical Chinese medicine prescriptions in the Oncology Department of the Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine from January 2021 to December 2021

表1 分组和给药剂量Table 1 Grouping and dosing

2.2 皮下瘤及原位移植瘤模型小鼠制备

2.2.1 皮下瘤小鼠制备 选取BALB/c小鼠5只,将对数生长期的CT26.WT细胞制成密度为1×107mL-1的单细胞混悬液,每只小鼠0.2 mL接种于右腋下,2周左右触摸右腋下有黄豆大小至皮下瘤体积约100 mm3后,颈椎脱臼处死皮下瘤小鼠,消毒后用镊子轻轻剥离肿瘤组织,放置于冰盒上已配好的双抗溶液(青霉素、链霉素)中,剔除坏死肿瘤组织,选取鲜嫩白色鱼肉状组织,用眼科剪剪至大小均一,约1 mm3体积的瘤块备用(全部操作均在冰上进行)。

2.2.2 原位移植瘤模型小鼠制备 结直肠癌原位移植瘤模型小鼠参考课题组前期及文献操作[16-19]。异氟烷麻醉小鼠后,调整流速持续麻醉,将小鼠四肢固定于鼠板,用小鼠剃毛刀剃除右下腹术野皮毛,采取“回”字法对切口周围先用75%乙醇消毒,再脱碘。无菌手术剪切口约1 cm左右,用镊子轻轻拉出盲肠找到盲结肠交界处,刮去表面浆膜,随机选取双抗中的1 mm3的瘤块,用Histoacryl医用组织胶固定,晾8～10 s,待组织胶凝固后将体外肠段纳入腹中,由内到外缝合皮下组织和皮肤,假手术组和模型组不粘瘤块。手术全程遵循无菌原则。在手术室观察小鼠至苏醒状态稳定后置于SPF级屏障系统常规饲养。

末次给药后第2天眼眶取血1～1.5 mL,保存于EP管,室温下静置1 h以上,颈椎脱臼处死小鼠,取材用于后续实验。手术剪剪开腹腔,观察有无腹水、观察肿瘤大小以及恶化程度,观察肝、脾转移灶情况,用镊子钝性分离完整的肿瘤、肝脏和脾脏组织。记录肿瘤、肝脏、脾脏在一般相机下的情况。游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)。计算各组瘤体体积(肿瘤体积=ab2/2)。取一部分肿瘤、肝等组织于4%多聚甲醛固定用于后期实验,另一部分放入冻存管于-80 ℃超低温冰箱中保存用于后期实验[16-19]。

2.3 HE染色病理学观察

剥离肿瘤与结肠组织后,用4%多聚甲醛溶液固定,经脱水、包埋、切片等处理后行常规HE染色,于显微镜下观察(其中假手术组小鼠所检测的肿瘤组织对比样品为该组小鼠与其他组原位移植瘤小鼠相对应位置的盲结肠组织)。

2.4 ELISA法检测原位移植瘤小鼠肿瘤中GSH-Px、MDA、SOD含量

按照ELISA试剂盒使用说明书分别进行对应步骤的试剂加样,酶标板中分别加入将标准液、样品液,加抗体工作液,水浴锅37 ℃孵育1 h,加底物37 ℃避光后孵育15 min,最后加终止液。在 450 nm波长范围用酶标仪测定吸光度A,绘制标准曲线,计算各样品浓度。

2.5 Western blot检测肿瘤与结肠组织相关蛋白表达水平

选取各组小鼠肿瘤及结肠组织(其中假手术组小鼠所检测的肿瘤组织对比样品为该组小鼠与其他组原位移植瘤小鼠相对应位置的盲结肠组织),提取蛋白后BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭。一抗p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4、Nrf2、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Snail(1∶500)4 ℃孵育过夜;二抗(1∶3 000)室温孵育2 h,按0.1 mL∶cm显影液计算用量,将显影液加于PVDF膜上,暗室中迅速将膜蛋白贴在X光胶片上曝光,洗片机中显影、洗像。调整曝光时间,直至出现最佳条带。结果使用光密度测量计扫描,使用ImageJ分析软件将条带灰度值数值化,其后将每组目的蛋白的灰度值除以GAPDH内参的灰度值得出相应的相对表达量。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 各组结肠癌模型小鼠一般生长状态比较

观察各组小鼠肿瘤、肝脏及脾脏形态(图2A～C),模型组小鼠解剖状态下可肉眼观察到肝叶与脾脏上有明显的肿瘤转移灶形成(蓝色箭头),肿瘤细胞构成单个或多个白色小结节嵌入式占位肝组织, 肝、脾转移灶数目显著减少或者没有发生转移,证实芪-术-蚤角药配伍可抑制肿瘤生长、转移。观察肿瘤大小,测量肿瘤体积发现(图2D),与模型组相比,阳性对照组、芪-术-蚤高剂量组与芪-术-蚤低剂量组肿瘤体积明显变小,表面较光滑,且芪-术-蚤高剂量组肿瘤体积小于芪-术-蚤低剂量组。

注:K.假手术组;M.模型组;5-FU.阳性对照组;HEZ-G.芪-术-蚤高剂量组;HEZ-D.芪-术-蚤低剂量组。A.原位移植瘤小鼠肿瘤解剖;B.原位移植瘤小鼠肝脏解剖图;C.原位移植瘤小鼠脾脏解剖图;D.小鼠肿瘤体积对比图;E.小鼠体质量变化图。与模型组相比,****P<0.000 1。与5-FU组比较,

本次实验造模成功率100%,通过绘制体质量曲线(图2E)发现,假手术组小鼠体质量呈稳定增长趋势,生长状况良好。模型组小鼠体质量自第10天开始呈显著下降趋势,且其毛发光泽欠佳,食欲不振,生存状况较差。与模型组相比,阳性对照组的小鼠体质量在前中期逐渐上升,在后期有所下降,且波动较大,腹腔给药后食欲不佳、且有呕吐现象,可能为化疗药对胃肠道副作用导致。芪-术-蚤高剂量组与芪-术-蚤低剂量组小鼠体质量下降现象有显著缓解,毛发较为光泽,精神状态较好,且从小鼠整体生存状态芪-术-蚤高剂量组效果更显著,此现象表明芪-术-蚤角药配伍对小鼠食欲不佳的现象有一定缓解作用,并发挥补气、活血和 解毒的功效使小鼠增强体质量,抑制肿瘤生长。

3.2 各组结肠癌模型小鼠病理学变化

如图3～4所示,电子显微镜下观察各组肝、肿瘤组织病理切片:模型组转移灶明显且数目多,转移灶处可见肿瘤细胞占位形成肿瘤细胞团,形态大小不一,排列杂乱无规则,细胞核数量增多,核浆比增大,呈现异型性,肝细胞分布不规则,肝索排列紊乱;芪-术-蚤高剂量组与芪-术-蚤低剂量组转移灶不明显,肝细胞排列有序,肝窦肝索形态正常,肝小叶边缘清晰,表明芪-术-蚤角药配伍能够显著改善结肠癌小鼠肝细胞的形态变化;模型组小鼠肿瘤细胞恶性增殖程度高,肿瘤有丝分裂较多,坏死区较少,芪-术-蚤高剂量组与芪-术-蚤低剂量组肿瘤细胞数目明显减少且密集程度下降,有丝分裂相对减少。

注:K.假手术组;M.模型组;5-FU.阳性对照组;HEZ-G.芪-术-蚤高剂量组;HEZ-D.芪-术-蚤低剂量组

3.3 各组氧化应激相关分子活性比较

ELISA法检测小鼠肿瘤及血清氧化应激相关分子水平,实验结果提示:与假手术组相比,模型组的各组数据均发生显著变化(P<0.000 1),说明造模成功;与模型组相比,芪-术-蚤高剂量组与芪-术-蚤低剂量组瘤体及血清中GSH-Px含量显著降低(P<0.05,P<0.001)、血清中MDA含量显著增加(P<0.001,P<0.000 1),芪-术-蚤高剂量组血清中SOD含量显著降低(P<0.01),且芪-术-蚤高剂量组效果优于芪-术-蚤低剂量组,这也从体内证实了芪-术-蚤角药配伍可一定程度影响移植瘤小鼠血清的氧化应激水平。见图5。

注:K.假手术组;M.模型组;5-FU.阳性对照组;HEZ-G.芪-术-蚤高剂量组;HEZ-D.芪-术-蚤低剂量组。A.肿瘤中相关指标水平;B.血清中相关指标水平。与M组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1;与5-FU组比较,#P<0.05,##P<0.01,####P<0.000 1;与HEZ-G组比较,▲P<0.05,▲▲▲▲P<0.000 1。

3.4 各组ER stress和EMT相关蛋白相对表达量比较

PERK/eIF2α/ATF4通路是调控ER stress的关键通路,图6结果提示:与模型组相比,芪-术-蚤高剂量组与芪-术-蚤低剂量组可显著增加p-PERK、p-eIF2α、ATF4的蛋白表达(P<0.01,P<0.01,P<0.001,P<0.000 1),提示芪-术-蚤角药可能通过PERK通路介导ER stress。EMT相关蛋白E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Snail表达的变化表明,与模型组相比,芪-术-蚤角药配伍可以显著增加E-Cadherin的蛋白表达(P<0.001),显著降低N-Cadherin、Vimentin、Snail的蛋白表达(P<0.01,P<0.001,P<0.000 1),且芪-术-蚤高剂量组较芪-术-蚤低剂量组效果更佳(P<0.05,P<0.01),这说明芪-术-蚤角药配伍可能通过介导ER stress,激活PERK通路,调节机体氧化应激水平,来影响结直肠癌EMT相关蛋白表达水平,从而抑制结直肠癌转移。

注:K.假手术组;M.模型组;5-FU.阳性对照组;HEZ-G.芪-术-蚤高剂量组;HEZ-D.芪-术-蚤低剂量组。与M组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与5-FU组比较,#P<0.05,##P<0.01;与HEZ-G组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01。

4 讨论

与传统化疗药物相比,中医药治疗疗效好、副作用小。临床数据表明,古今抗肿瘤中药类别频次以补益药、活血化瘀药、清热解毒药居多,其中黄芪、莪术、重楼位于前列[18]。使用芪-术-蚤角药配伍治疗肿瘤,固本之余,化瘀解毒,在抗肿瘤转移与降低复发率方面均具较好疗效。从肿瘤病机来看,芪-术-蚤三者合用益气调营,化瘀消浊,解毒散邪,抵抗“虚、瘀、毒”状态。

ER stress是一个高度动态过程,也是介导EMT的重要因素之一,肿瘤细胞内发生持久稳定而程度适中的ER stress时,UPR被持续激活,为肿瘤细胞提供了一个适宜生存的温室,此时机体处于中医理论“虚、瘀、毒”的病理状态,促进肿瘤细胞的发生、发展、转移、耐药和免疫逃逸等。PERK是能介导ER stress的跨膜蛋白激酶,在发生UPR时,PERK被激活,使p-eIF2α磷酸化,继而激活下游ATF4,上调人内质网应激相关蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP),导致细胞凋亡。同时,研究表明[19-20]活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生被证实与ER stress和UPR有着密切的联系,CHOP作为UPR途径促凋亡因子,会使大量ROS累积,影响氧化应激,ER stress与氧化应激主要调节相关转录因子(EMT-transcription factors,EMT-TFs)[21-24],抑制EMT进程,使机体的“虚、瘀、毒”状态得到改善,抑制结直肠癌生长、转移。

课题组前期研究表明芪-术-蚤角药配伍可多通路、多靶点抑制结直肠癌CT26.WT细胞小鼠原位移植瘤生长、转移,但未以ER stress为切入点探讨其抑制结直肠癌转移的机制,该研究证实芪-术-蚤角药配伍在分子水平介导的病理学ER stress与氧化应激可能是其抑制结直肠癌转移作用的关键机制,如图7所示。

图7 芪-术-蚤角药配伍抗结直肠癌机制图Fig.7 Diagram of mechanism hypothesis of Qi-Zhu-Zao (Astragalus mongholicus Bunge-Curcuma aromatica-Rhizoma Paridis) against colon cancer

本研究通过检测结直肠癌CT26.WT细胞原位移植瘤小鼠组织中的PERK/eIF2α/ATF4信号通路相关蛋白p-PERK、PERK、p-elF2α、elF2α、ATF4和EMT过程关键蛋白E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Snail的表达水平及氧化应激相关指标GSH-Px、MDA、和SOD水平,探讨芪-术-蚤角药配伍对结直肠癌CT26.WT细胞原位移植瘤小鼠组织ER stress关键通路PERK/eIF2α/ATF4及氧化应激水平对肿瘤转移EMT过程的作用,结果表明芪-术-蚤角药配伍通过上调PERK、eIF2α磷酸化水平,增加了下游蛋白ATF4表达,影响机体氧化应激水平,稳定机体Nrf2表达,降低SOD和GSH-Px含量,升高MDA含量,从而调控EMT过程,使E-Cadherin上调、N-Cadherin、Vimentin和Snail下调,证实ER stress通路PERK/eIF2α/ATF4被激活,ER stress与氧化应激相互影响、共同调控EMT过程,发挥抗肿瘤作用,抑制结直肠癌生长、转移,以期为后续基于芪-术-蚤角药配伍及其复方临床运用提供依据。本实验未沉默PERK后检测ER stress通路PERK/eIF-2α/ATF4及EMT相关蛋白水平,研究结果存在一定局限性。