5种猪源消化道传播病原体荧光定量PCR检测方法的建立

吴静波,南文金,胡鸿惠,黄健强,彭国良,3

(1. 韶关学院英东生物与农业学院,广东 韶关 512005 ; 2. 粤北生猪生产及疫病防控协同创新发展中心,广东 韶关 512005 ; 3. 广东省粤北生猪养殖废弃物减量化工程技术研究中心,广东 韶关 512005)

新型冠状病毒疫情发生以来,人兽共患病受到越来越多的关注。消化道传播是人兽共患病病原体的主要传播途径,相关病原体可通过污染的食物和水源等感染人类,引起消化系统疾病,造成大范围的传播,严重危害公共卫生安全[1-2]。猪群中常见人兽共患病病原体包括大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)(主要为产志贺毒素大肠杆菌)、沙门菌(Salmonella)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、志贺菌(Shigella)和戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)等,其均主要通过消化道传播,对人类危害较大。这些病原体传播过程中主要的传染源就是患病猪的加工产品及其排泄物,而且在生猪生产、加工、流通和食用等整个过程都有可能造成人类感染[2-4]。近年来,上述5种人兽共患病病原体在世界各地都有不同规模的散在暴发流行,不仅威胁食品安全和人类健康,同时也给生猪上下游产业带来了严重的负面影响,造成了极大的经济损失[3,5-7]。例如,2017年英国和威尔士HEV感染引起的“毒猪肉”事件中,因食用同一超市的火腿就导致近60人发病;进一步研究显示,该地区每年有近20万人因猪肉相关制品而感染HEV[8];而2009—2015年美国发生的食源性疾病中,82%的住院病例和82%的死亡病例是由李斯特菌、沙门菌和产志贺毒素大肠杆菌引起的,其中10%的病例经猪肉传播[9];并且数学模型显示,经猪肉传播的趋势有可能进一步上升[10]。因此,实现对猪肉制品从产地到餐桌全流程的监测和控制,及早筛选和排除传染源是非常有必要的,可以极大降低生产者和消费者的感染风险[4],亟需建立快速、准确、高效的检测手段,实现对多种形式的样品进行检测,包括但不限于动物组织、环境样品、排泄物和培养物等样品。

目前,传统的病原体分离培养仍是上述5种病原体的检测金标准,包括增菌(只限细菌)、分离培养、纯化和鉴定等步骤,过程复杂、耗时长、灵敏度低,而且不能满足大量样品的快速检测;尤其是不能对多个病原体同时检测,不能区分多个病原体的混合感染[11]。为解决上述问题,本试验运用TaqMan多重荧光定量PCR技术,将检测大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌和志贺菌4种细菌病原体的引物和探针混合,以不同的荧光标记,建立四重荧光定量PCR检测方法,同时建立HEV荧光定量PCR检测方法,并将2个荧光定量PCR的退火温度统一,以实现对5种病原体的同时检测,并且实现对样品中各病原体含量的定量分析,为监测提供更为全面的数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Pro Taq HS Premix Probe qPCR试剂盒和Evo M-MLV反转录试剂盒,均购自湖南艾科瑞生物工程有限公司;pMDTM18-T Vector Cloning Kit、Easy Dilution II (for Real Time PCR)、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit和MiniBEST Universal RNA Extraction Kit,均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 主要仪器 ABI 7500荧光定量PCR系统,美国ABI公司产品;NanoDrop ND-2000C微量紫外分光光度计,赛默飞世尔科技公司产品。

1.3 细菌和病毒来源 实验涉及的菌株均为本实验室购买或分离保存,阳性对照病原体包括大肠杆菌(ATCC 25922)、志贺菌(ATCC 12022)、沙门菌和单增李斯特菌。HEV阳性cDNA样品为本实验室从患病猪肠道组织内提取的RNA经逆转录获得并保存。阴性对照选用猪场常见病原体,包括金色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎链球菌(ATCC 49619)、化脓性链球菌(ATCC 19615)、粪肠球菌(ATCC 29212)、乙型溶血性链球菌(ATCC 21059)、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、猪鼻支原体(CVCC 361)、马链球菌兽疫亚种(CVCC 573)、猪圆环病毒、猪伪狂犬减毒疫苗病毒、猪瘟减毒活疫苗病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的减毒活疫苗病毒。

1.4 引物和探针设计 以各病原体基因组中保守的种属特异性基因作为靶基因,设计多重荧光定量PCR的引物和探针。使用MEGA 5.1和DNAMAN软件进行序列比对,最终确定以大肠杆菌和志贺菌共同的保守基因uidB(2种细菌相似性达97.24%)、志贺菌的种属特异性基因ipaH(种属内一致性98.67%)、沙门菌种属特异性基因invE(种属内一致性98.97%)、李斯特菌的种属特异性基因plcB(种属内一致性98.47%)和HEV的结构基因orf1(4个血清型之间一致性81.24%)作为靶基因。设计的引物和探针如表1所示,为实现对5种病原体的同时检测,在设计时各病原体引物的退火温度控制在(58±2)℃,探针的退火温度控制在(61±2)℃,以确保5种病原体能够在同一退火温度下进行扩增。另外,除了HEV是6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,FAM)单荧光检测之外,其他的4种细菌病原体设计的是四重荧光检测,选择的报告荧光分别是磺基罗丹明(Sulforhodamine,Texas Red)、花菁5(Sulfo-cyanine 5,Cy5)、FAM和二氯二甲氧羧基荧光素(Dichloro dimethoxy carboxyfluorescein,JOE)。使用Oligo 7软件进行引物和探针设计,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物和探针序列信息

1.5 反应条件和体系的优化和确定 首先在缓冲液推荐的反应体系下进行退火温度的优化,设置56、58和60 ℃共3个退火温度,反应条件为94 ℃ 5 min预变性和启动ExTaq酶,然后94 ℃ 15 s变性,56～60 ℃ 30 s退火延伸并收集荧光,共40个循环;从基因提取到检测完成大概只需要1.5 h。在确定退火温度后,对引物和探针反应浓度进行优化,设计3×3矩阵表(表2)分为9个组对每种病原体的反应体系进行优化,包括3个引物浓度(200、300和400 nmol/L)和3个探针浓度(100、150和200 nmol/L)。使用25 μL反应体系,包括12.5 μL PremixExTaqBuffer(2×),0.5～1.0 μL引物(10 μmol/L),0.25～0.50 μL探针(10 μmol/L),1 μL细菌基因组DNA样品或病毒RNA逆转录后的cDNA样品(DNA或cDNA样品浓度不低于50 ng/μL),无RNA酶水补至25 μL,注意不加入ROX染料。

表2 引物和探针浓度优化的矩阵分组

1.6 标准曲线的绘制 在荧光定量PCR目标片段的上、下游另设计1对引物,扩增的目的片段与pMD18-T载体连接后构建各检测病原体的质粒标准品。纯化后的阳性质粒标准品经NanoDrop ND-2000C测定浓度,计算质粒原始拷贝数,然后用标准品稀释液将各病原体的质粒标准品进行10倍梯度稀释,浓度为1×109～1×101copies/μL,共9个梯度,每个浓度设置3个复孔。以质粒标准品的拷贝数log10值为横坐标,荧光定量PCR的Ct值为纵坐标,绘制标准曲线,并计算相关系数和扩增效率。

1.7 特异性分析 用所确定的最优反应体系和条件对1.3中的5种阳性对照和16种阴性对照的基因组DNA或cDNA进行检测,以检验建立的方法是否能够在准确鉴定出各目标病原体的同时,不对作为阴性对照的病原体产生扩增反应;并验证5种目标病原体之间是否存在交叉的非特异性反应。

1.8 灵敏度分析 将各病原体的质粒标准品分别稀释至20、10、5和2 copies/μL共 4个浓度,用最优反应体系和条件进行检测,每个浓度3个复孔,以测定所建立方法的检测极限值(灵敏度)。

1.9 重复性分析 使用与临床样品相似拷贝数范围的质粒标准品(浓度为1×107～1×103copies/μL,共5个梯度)进行重复检测,每个浓度3个复孔,在不同时间点进行3次检测;计算各浓度样品检测结果批内和批间的变异系数(Coefficient of variation,CV),以检验所建立方法的重复性。

1.10 临床样品检测 对117份实验室收集的临床样品[包括冻存临床样品(肺脏、淋巴结、肝脏和脾脏)及市场采集样品(粪便、肝脏和肌肉)]应用所建立的荧光定量PCR进行检测,并与相应病原体的普通PCR[11-13]进行平行检测,对比2种检测方法的结果。运用商品化的核酸提取试剂盒提取样品的基因组DNA和RNA,运用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA,以DNA或cDNA作为模板进行检测。根据试验结果,以SPSS软件中配对样品的χ2检验来分析和计算2种PCR方法的符合率和一致性(Kappa系数)。

2 结果

2.1 反应条件和体系的优化和确定 结果如表3所示,同一样品在不同退火温度下的扩增曲线都出现典型的“S”型,且检测结果差别不明显,综合5种病原体的检测结果,最佳的退火温度统一为58 ℃;9个引物和探针浓度组合之间的检测结果差别较大,四重荧光定量PCR的最佳浓度组合是C1,即反应中引物和探针的终浓度都是200 nmol/L;HEV荧光定量PCR的最佳浓度组合是C3,即引物浓度为400 nmol/L,探针浓度为200 nmol/L。

表3 反应条件和体系优化结果

2.2 标准曲线的绘制 在确定的最优荧光定量PCR反应体系和条件下分别对各病原体的质粒标准品进行检测,各质粒标准品均只单独出现对应目的基因的荧光扩增曲线,即各标准品之间不存在非特异扩增,绘制的标准曲线如图1所示,9种病原体质粒标准品浓度梯度的检测Ct值与对应拷贝数的log10值均呈现明显线性关系,且线性范围较宽,线性范围介于101～ 109;标准曲线的相关系数(Correlation coefficient,R2)也较高,范围介于0.997～0.999;标准曲线斜率范围介于-3.315～-3.211,对应的扩增效率介于101.975%～113.247%。

图1 5种病原体质粒标准品的标准曲线

2.3 特异性分析 对阳性对照病原体的检测结果如表4所示,四重荧光定量PCR方法检测大肠杆菌和志贺菌的基因组DNA时FAM荧光(uidB基因)均为阳性,并且志贺菌的检测中JOE荧光(ipaH基因)也为阳性,即四重荧光定量PCR检测中,FAM荧光单阳性为大肠杆菌,FAM和JOE荧光双阳性为志贺菌;对李斯特菌和沙门菌的检测也分别只出现Texas Red(plcB基因)和Cy5(invE基因)荧光,其他荧光都为阴性。而HEV单荧光定量PCR检测中,只有在检测HEV cDNA时FAM荧光(orf1基因)为阳性。同时,在对16种阴性对照病原体的检测中,所有荧光均为阴性(结果未显示)。结果表明,建立的荧光定量PCR方法可特异性鉴别5种病原体。

表4 荧光定量PCR的报告荧光基团和检测极限值

2.4 灵敏度分析 荧光定量PCR检测极限值的结果如表4所示,5种病原体的荧光定量PCR都只在检测5 copies/μL以上模板量时才出现典型的扩增曲线,即建立的荧光定量PCR方法对5种病原体的检测极限值都是5 copies/μL。不过在低于10 copies/μL时检测的稳定性会下降,3个复孔Ct值的标准差最大可达0.7。

2.5 重复性分析 根据质粒标准品(103～107copies/μL)的3次重复检测结果绘制误差限图,如图2所示,单增李斯特菌(plcB基因)重复检测Ct值的标准差为0.12～0.34,组内变异系数为0.06%～3.16%,组间的变异系数为0.43%～2.09%;沙门菌(invE基因)重复检测Ct值的标准差为0.24～0.37,组内变异系数为0.44%～2.21%,组间的变异系数为0.76%～2.02%;大肠杆菌和志贺菌通用基因(uidB基因)重复检测Ct值的标准差为0.14～0.43,组内变异系数为0.27%～2.11%,组间的变异系数为0.60%～1.40%;志贺菌(ipaH基因)重复检测Ct值的标准差为0.09～0.15,组内变异系数为0.17%～0.73%,组间的变异系数为0.35%～0.73%;戊型肝炎病毒(orf1基因)重复检测Ct值的标准差为0.27～0.40,组内 变异系数为0.38%～2.73%,组间的变异系数为1.06%～2.28%。5种病原体基因检测值的组内和组间变异系数均远小于5%,表明建立的荧光定量PCR方法稳定性较高,其中稳定性最高的是志贺菌的ipaH基因。

图2 5种病原体重复检测Ct值的误差限图

2.6 临床样品检测 对117份临床样品的检测结果如表5所示,单增李斯特菌、沙门菌、大肠杆菌、志贺菌和HEV荧光定量PCR的阳性率分别为6.84%、17.95%、31.62%、5.13%和11.11%;其中混合感染样品占阳性样品的42.85%(24/56)。与普通PCR的检测结果对比显示,单增李斯特菌和志贺菌2种检测方法的符合率是100%。但是沙门菌、大肠杆菌和HEV的符合率依次只有98.29%、95.73%和98.29%,对应的Kappa值是0.940、0.897和0.907;沙门菌、大肠杆菌和HEV荧光定量PCR中的阴性样品,普通PCR也全是阴性;而且2种方法检测结果不符的样品中,荧光定量PCR检测显示的原始拷贝数都在50个拷贝以下,超过了普通PCR的检测极限,初步说明荧光定量PCR的检测灵敏度更高。

表5 荧光定量PCR和普通PCR检测临床样品的结果对比分析

3 讨论

粪口传播途径是猪源消化道病原体感染人类的主要传播途径,包括通过食用猪肉及其加工产品直接感染,以及食用受猪排泄物污染的饮水或食物间接感染2种方式。因此,携带病原体的猪肉和猪场粪污是人和猪共患病的主要传染源,生猪生产、加工、储存、运输、销售和食用等各个环节都有可能造成病原体的传播,而及时筛选出传染源进行隔离和处理是防止疾病暴发的最有效方法[4]。由此可见,建立一种适用于不同环节、不同样品的病原体快速检测方法非常重要。本试验所选用的荧光定量PCR方法可以实现对全环节样品中病原体核酸的检测,包括饲养环节中动物的粪便、组织、拭子、血液和污水等,加工后的肉制品,以及病人的血液、拭子、呕吐物、排泄物和分离培养微生物等。

人和猪之间传播的食源性病原体分为细菌和病毒两大类。细菌主要包括沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌(主要为产志贺毒素大肠杆菌)、单增李斯特菌、志贺菌和弯曲杆菌等。研究显示,美国37%的食源性疾病[9],我国32.7%的细菌性腹泻是由沙门菌、大肠杆菌和志贺菌感染造成[14],它们都能引起急性胃肠炎,临床症状比较相似,所以需要依靠实验室诊断才能进行区分。单增李斯特菌危害较大,人类和动物感染后可引起败血症和脑膜炎等;平均致死率在我国约为18%,全球约为30%,新生儿致死率甚至可达到70%以上,是食源性疾病中必须要检测的细菌性病原体[15]。上述4种病原菌在显微镜下都呈杆状,且易存在混合感染,本试验检测的117份样品中混合感染占阳性样品的42.85%(24/56),所建立的沙门菌、大肠杆菌、单增李斯特菌和志贺菌四重荧光定量PCR方法,能够实现同时对这4种主要食源性细菌的区分检测,避免出现误诊和漏诊,提高了诊断的准确性。

除了在人群中流行,上述4种病原菌在生猪群体和肉制品中的感染率也比较高。本试验的检测结果显示,沙门菌、大肠杆菌、单增李斯特菌和志贺菌在117份猪源样品中的阳性率分别是17.95%、31.62%、6.84%和5.13%,总阳性率是47.86%(56/117),提示本地区猪群中携带的食源性细菌病原体以大肠杆菌和沙门菌为主,而且这2种细菌的阳性率稍高于其他研究者在本地区的调查结果(22%和14.06%)[16-17]。本试验中单增李斯特菌的阳性率低于我国28个省份市售生鲜猪肉产品中单增李斯特菌的平均污染率(11.68%)[18],这也反映了猪肉从屠宰、运输到销售环节中单增李斯特菌的污染是逐级放大的[19]。另外,本试验中志贺菌的阳性率稍高于酒泉市售卖猪肉中志贺菌的阳性率(1.48%)[20],但远低于仔猪腹泻样品中志贺菌的阳性率(41.27%)[21]。

HEV是近年来新兴的人兽共患病毒,在全球范围内广泛流行。猪感染HEV一般无明显肝炎临床表现,但引起的病毒血症最长可持续3个月,期间粪便可持续排毒[22],所以受感染猪是HEV最主要的传染源。研究显示,我国商品猪群中抗HEV的IgG抗体阳性率可达到83.4%,美国类似,阳性率介于66.7%～93.9%;但是我国健康人群的抗体阳性率约为32.6%,远远高于美国健康人群的18.8%[23]。出现如此大的差距的原因可能是我国缺少猪肉制品和猪场污水中HEV的监测机制。研究显示,我国各地猪场组织样品的HEV阳性率介于4.75%～7.6%[24-25],粪便中的阳性率会稍高一点,介于15.6%～35.9%[26-28]。本试验的检测结果显示,HEV阳性率是11.11%,其中阳性样品也主要是粪便样品,占比76.92%(10/13)。

与普通PCR方法相比,荧光定量PCR方法具有引物和探针的双重特异性,本试验建立的荧光定量PCR方法能准确检测出5种病原体,除了靶基因uidB可检测出志贺菌和大肠杆菌之外,其他细菌的靶基因相互之间无交叉反应,且对常见的阴性对照细菌无非特异性反应,表现出较高的特异性。其次,本试验建立的荧光定量PCR可以在1.5 h内完成对大量样品的处理和检测,全程闭管操作,不仅降低了产物污染的风险,而且极大地减少了劳动量,节约了成本。另外,荧光定量PCR最大优势是灵敏度高,线性范围宽,可重复性强,能够根据标准曲线对样品模板进行准确定量。本试验建立的荧光定量PCR方法的检测极限值可达到5个拷贝,线性范围涵盖9个数量级,标准曲线的相关系数可达到0.997～0.999,扩增效率都超过100%;但对于低于10个拷贝的样品进行检测时,结果稳定性较差,说明本方法对10个拷贝以下的样品(超过标准品线性范围样品)无法准确定量,只能定性检测。另外,本试验建立的荧光定量PCR重复检测结果的标准差和变异系数分别低于0.4和3.16%,表现出较高的稳定性。

普通PCR方法的检测极限值为100个拷贝以上[6,12-13],明显低于本试验建立的荧光定量PCR方法,所以在临床样品的平行检测中,部分原始模板量较低的样品普通PCR检测结果为阴性,而荧光定量PCR检测结果却出现典型的扩增曲线。这也是导致沙门菌、大肠杆菌和HEV的2种检测方法符合率分别只有98.29%、95.73%和98.29%,而李斯特菌和志贺菌的符合率可达到100%的原因。但是统计分析结果显示,5种病原体的Kappa值都大于0.85,一致性较高,基本满足临床样品检测对灵敏度和特异度的要求。

综上所述,本试验所建立的荧光定量PCR方法可实现单增李斯特菌、沙门菌、大肠杆菌、志贺菌和HEV的同时、快速和准确诊断。该方法非常适合大量临床样品的检测,尤其是临床症状复杂的多重感染样品,能够为猪源食源性疾病的诊断和防控提供有力的技术支持,实现传染源的及早隔离,切断疾病的传播途径。同时能够为肉制品和猪场污水中人兽共患病病原体的净化做前期准备,以达到“产品安全”和“环境友好”的现代化养殖要求,推动生猪养殖业的健康和可持续发展。