连续秸秆还田条件下氮肥减施对稻田土壤真菌多样性的影响

周榆越，焦峰

（黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319）

我国是农业大国，水稻种植面积达到了26%～28%，水稻产量占粮食总产的43%～45%[1]。水稻高产优质离不开养分，氮素是水稻生长和产量形成的首要因素，我国水稻种植过程施氮量都很高，平均施用水平在150～400 kg·hm-2[2]，各地施氮水平不一。土壤中的氮素主要来自大气干沉降带入的氮、化肥和有机肥施用的氮、作物秸秆还田归还的氮，其中化肥与有机肥中的氮对土壤氮肥综合影响较大[3]。刘红江等[4]试验研究表明，太湖地区高产稻田当地习惯施氮量（360 kg·hm-2）上减氮10%，水稻产量提高1.9%，还能显著提高氮肥利用率、氮肥偏生产率。颜双双[5]研究发现，在降低氮肥施用的同时，通过秸秆还田可改善土壤理化性质、促进作物增产、增加土壤细菌、真菌和放线菌数量。Hong 等[6]研究表明，施用尿素处理下的秸秆还田土壤溶液中溶解性有机氮具有较好的微生物降解特性，降解后成为植物重要的吸收氮源[7]，能够增加水稻土壤中微生物活性[8]，提高土壤微生物氮含量[9]，改变农田土壤真菌多样性[10]。袁嫚嫚等[11]研究发现，秸秆还田条件下，作物养分积累量可以通过调控氮肥用量与增施磷钾肥取得显著提高。

土壤微生物在维持农田土壤健康、生产力及其可持续性等方面具有非常重要的作用，它既是土壤有机质和养分转化与循环的动力，又可作为土壤中植物有效养分的储备库[12]。真菌是土壤微生物的重要组成，直接影响土壤有机质循环、养分转化、有毒物质降解和作物病害发生等[13-15]，是土壤肥力和健康的重要指标之一[16]。吴秀红等[17]在水稻秧盘育秧接种不同浓度真菌后发现，接种真菌的水稻根数显著高于对照组。真菌数量虽不如细菌和放线菌多，但对秸秆腐蚀分解有着重要的影响，目前秸秆还田对土壤微生物影响的报道较多，但国内外关于长期连续多年秸秆还田条件下氮肥减施，真菌群落结构研究甚少[18-19]。试验基于长期水稻秸秆还田及氮肥减施试验的基础上，采用高通量测序技术方法，探究连续多年秸秆还田条件下与氮肥减施系统对土壤真菌微生物的影响，以讨论稻田秸秆全量还田在改善土壤生态环境方面的可行性，为推行秸秆全量还田，实现培肥土壤、藏粮于地提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试品种为龙粳31。

1.2 试验地概况

试验设在黑龙江省建三江管理局前进农场科技园区，试验用地土壤类型为潜育白浆土，土壤性质见表1。小区总面积为1 050 m2，各小区长度15 m、宽度10 m。

表1 潜育白浆土基本性质Table 1 Basic properties of latent white pulp soil

1.3 试验设计

长期定位点开始于2015 年，试验开始于2021 年，试验共7 个处理，秸秆还田方式在水稻收获后，将秸秆碎混翻埋还田，处理方式见表2，常规（100%）氮肥施用量为150 kg·hm-2；减氮（10%）施用量为135 kg·hm-2；减氮（20%）施用量为120 kg·hm-2；减氮（30%）施用量为105 kg·hm-2。供试氮肥为尿素（N 46%），磷肥为重过磷酸钙（P2O546%），钾肥为硫酸钾（K2O 50%）。各小区严格实行单灌单排，田间管理方式按照水稻常规生产技术措施标准统一执行。

表2 各处理还田及施肥方式Table 2 Treatment and fertilization methods

1.4 试验方法

1.4.1 土壤样品采集

试验第7 年水稻收获后，在每个小区随机划分3个1 m2区域，用土钻按混合采样法采集0～20 cm 土层的土壤样品，去除土样中动植物残体等杂质，混合均匀后装入自封袋，编号标记，用于分析土壤真菌群落结构。

1.4.2 土壤微生物高通量测序

采用PowerSoil DNA 提取试剂盒（美国QIAGEN公司）提取土壤微生物总DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取质量，-20 ℃冰箱保存，供后续试验使用。以上述检测到的DNA 为模板，采用带有barcode 的特异性引物ITS1-F（5′_GGAAGTAAAAGT CGTAACAAGG_3′）和ITS2-R（5′_GCTGCGTTCTTCATCGATGC_3′）扩增真菌ITS1 区。采用50 μL 扩增体系：DNA 模板1μL，上游和下游引物各1 μL，2×PCR Premix 25 μL，ddH2O 22 μL。扩增程序为：95 ℃预变形3 min；35 个循环为95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃60 s；72 ℃终延伸10 min。采用核酸纯化试剂盒Agencourt AMPure XP 对PCR 扩增产物进行纯化，等量混匀后由北京奥维森基因科技有限公司进行高通量测序。当测序原始数据下机之后，首先进行数据质控，然后进行序列拼接等程序，得到优化序列，OTU聚类及注释在97%相似度水平进行，从而使分析结果更加准确、可靠。基于聚类结果，通过进行Alpha 多样性分析和Beta 多样性分析得出各水平分类信息，将样本组成和群落结构差异进行相关分析。

1.5 数据分析

采用Origin 进行基础柱状图的绘制；采用Excel 2016 软件进行基础数据的整理；采用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析（P＜0.05）；采用联川生物云平台进行LefSe 分析图的绘制。

2 结果与分析

2.1 秸秆还田条件下氮肥减施对土壤真菌群落高通量测序质量分析

21 个样品测序共获得2 436 299 对Reads，双端Reads 序列拼接后共产生2 061 364 条Clean Reads，每个样品至少产生33 355 条Clean Reads，平均产生98 160 条Clean Reads。通过使用Usearch 软件对Reads 在97.0%的相似度水平下进行聚类，获得各处理的OTU 个数（图1）。如图1（A）所示，处理组N0S0、N0S、NS、N1S、N2S、N3S 和对照组NS0的OTU 个数分别为279、283、257、319、325、331 和319。其中，氮肥减施20%（N2S）处理组和氮肥减施30%（N3S）处理组OTU 个数高于（NS0）对照组，不施氮不施秸秆（N0S0）、不施氮肥施秸秆（N0S）和施氮肥施秸秆（NS）处理组OTU 个数低于（NS0）对照组。如图1（B）所示，各组间共有OTU 个数为193，无特有OTU 数。

图1 样品OTU 个数分布图Fig.1 Distribution of the number of OTU in the sample

真菌等级丰度曲线与稀释性曲线能够真实反映土壤真菌群落物种多样性。如图2（A）所示，随物种等级的增大曲线在横轴的长度逐渐变宽，物种组成丰富；曲线逐渐趋于平缓，物种组成均匀度高。如图2（B）所示，不同处理组的土壤样品OTU 个数随样品序列数的增加而增加，当曲线逐渐趋于平缓，即OTU个数逐渐趋于饱和，说明到达一定序列数。综上可知，此次研究测序数据量足够大，样品物种丰富度和均匀度较高，测序结果能够反映土壤微生物多样性。

图2 真菌等级丰度曲线（A），真菌稀释性曲线（B）Fig.2 Fungal grade abundance curve（A），fungal dilution curve（B）

2.2 秸秆还田条件下氮肥减施对土壤样品真菌群落Alpha 多样性的影响

对不同秸秆还田氮肥减施处理的土壤真菌群落进行Alpha 多样性分析，结果如图3 所示。其中，ACE指数和Chao1 指数表征微生物群落丰富度；Shannon指数和Simpson 指数表征微生物群落多样性。由图3可知，氮肥减施20%（N2S）处理组样品ACE 指数和Chao1 指数显著高于不施氮不施秸秆（N0S0）、不施氮肥施秸秆（N0S）和施氮肥施秸秆（NS）处理组，氮肥减施30%（N3S）处理组样品ACE 指数和Chao1 指数显著高于不施氮不施秸秆（N0S0）和施氮肥施秸秆（NS）处理组，其他处理间物种丰富度指数差异不显著；氮肥减施20%（N2S）处理组Simpson 指数显著高于不施氮肥施秸秆（N0S）、氮肥减施10%（N1S）处理组和不施秸秆常规施用氮肥（NS0）对照组，Shannon 指数均显著高于其他各组。综上所述，不同处理的土壤样品Alpha 多样性存在差异，与对照组相比，氮肥减施20%（N2S）处理可显著提高土壤真菌群落物种多样性，物种丰富度虽有提高，但效果不显著。

图3 样品Alpha 多样性指数分析图Fig.3 Sample Alpha diversity index analysis chart

2.3 秸秆还田条件下氮肥减施对土壤样品真菌群落结构的影响

图4 为不同秸秆还田氮肥减施处理对土壤样品真菌群落门水平和属水平物种分布图。21 个土壤样品共检测到的真菌分属于10 门、26 纲、48 目、88 科和125 属。

图4 物种相对丰度分布图Fig.4 Relative abundance of species

由图4（A）可知，真菌门水平上，各处理中相对丰度均大于1%的优势物种为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、被胞霉门（Mortierellomycota）和unclassified_Fungi，相对丰度分别为24.20%～56.48%、20.00%～50.12%、13.91%～40.89%和1.31%～10.88%。对相对丰度前四的优势菌属分析可知，氮肥减施30%（N3S）处理组中子囊菌门的相对丰度分别显著高于不施氮不施秸秆（N0S0）23.00%、不施氮肥施秸秆（N0S）29.57%、氮肥减施10%（N1S）处理组32.28%和不施秸秆常规施用氮肥（NS0）对照组22.76%；氮肥减施10%（N1S）处理组担子菌门相对丰度显著高于不施氮肥施秸秆（N0S）处理组23.80%，其他处理间差异不显著；氮肥减施20%（N2S）处理组和氮肥减施30%（N3S）处理组被胞霉门相对丰度分别显著低于不施氮肥施秸秆（N0S）处理组24.57%和26.98%；氮肥减施20%（N2S）处理组unclassified_Fungi 相对丰度分别显著高于不施氮不施秸秆（N0S0）5.81%、不施氮肥施秸秆（N0S）7.37%、施氮肥施秸秆（NS）7.90%、氮肥减施10%（N1S）9.57%和不施秸秆常规施用氮肥（NS0）对照组8.58%，其他处理间差异不显著。

由图4（B）可知，真菌属水平被孢霉属（Mortierella）、Solicoccozyma 和unclassified_Fungi 为各处理优势菌属，相对丰度分别为13.90%～40.88%、3.60%～15.23%和1.31%～10.88%。对相对丰度居于前三的优势菌属分析可知，不施氮肥施秸秆（N0S）处理组被胞霉属相对丰度显著高于氮肥减施20%（N2S）和氮肥减施30%（N3S）处理组24.58%和26.97%，其他处理间差异不显著；不施秸秆常规施用氮肥（NS0）对照组Solicoccozyma 相对丰度分别显著高于不施氮不施秸秆（N0S0）、施氮肥施秸秆（NS）和氮肥减施10%（N1S）处理组5.54%、7.25%和11.43%；氮肥减施20%（N2S）处理组unclassified_Fungi 相对丰度分别显著高于不施氮不施秸秆（N0S0）、不施氮肥施秸秆（N0S）、施氮肥施秸秆（NS）、氮肥减施10%（N1S）和不施秸秆常规施用氮肥（NS0）对照组5.81%、7.37%、7.90%、9.57%和8.58%，其他处理间差异不显著。

为进一步明确各处理间在群落物种组成上的差异性，采用PCoA 分析不同秸秆还田氮肥减施处理土壤微生物群落物种组成的相似度。由图5 可知，细菌群落PC1 和PC2 分别为37.17%和12.47%，两者累计贡献率达50.64%。不同秸秆还田氮肥减施处理土壤微生物群落组间差异极显著（P＜0.01）。其中，NS、N1S、N0S0和N0S 组样品较聚类，组间差异较小；N2S、NS0和N3S 组样品较聚类，组间差异较小；但NS、N1S、N0S0、N0S 组和N2S、NS0、N3S 组样品组间差异较大。

图5 土壤真菌群落结构PcoA 分析Fig.5 PcoA analysis of soil fungal community structure

2.4 秸秆还田条件下氮肥减施土壤样品真菌群落LEfSe 分析

不同秸秆还田氮肥减施处理的土壤样品真菌群落组成和结构存在差异，进一步通过先行判别分析，确定各分类水平上各处理组间具有显著差异的关键物种及其效益大小。对不同处理的所有样品进行LEfSe 分析可知（图6），共有26 种具有显著差异的物种信息在门、纲、目、科、属水平上。其中，不施氮肥施秸秆（N0S）处理组有3 种具有显著差异的物种，分别为阿太菌目、阿太菌科和阿太菌属；氮肥减施10%（N1S）处理组有4 种具有显著差异的物种，分别为线黑粉菌目、Piskurozymaceae 科、Solicoccozyma 属和Lasiosphaeriaceae 科；氮肥减施20%（N2S）处理组有8 种具有显著差异的物种，分别为unclassified_Fungi 纲、unclassified_Fungi 目、unclassified_Fungi 科、unclassified_Fungi 门、unclassified_Fungi 属、壶菌门、未分类格孢腔菌属和未分类格孢腔菌目科；氮肥减施30%（N3S）处理组有4 种具有显著差异的物种，分别为子囊菌门、锤舌菌科、Helotiales_fam_Incertae_sedis 科和柔膜菌目；不施氮不施秸秆（N0S0）处理组仅有1 种具有显著差异的物种Triangulaira 属；不施秸秆常规施用氮肥（NS0）对照组有6 种具有显著差异的物种，分别为粉褶菌科、粉褶菌属、Echria 属、unclassified_Boletales 科、unclassified_Boletales 属和牛肝菌目。

图6 土壤真菌群落LEfSe 分析Fig.6 LEfSe analysis of soil fungal communities

2.5 秸秆还田条件下氮肥减施土壤样品功能基因预测分析

基于FUNGuild 的功能预测分析表明，未定义腐生菌、木质腐生菌、排泄物腐生菌、土壤腐生菌、植物寄生物、植物病原菌、植物腐生菌、内生植物、真菌寄生菌和动物病原菌等功能基因相对丰度较高。对相对丰度居于前6 的功能基因进行分析，结果如图7所示。与不施秸秆常规施用氮肥（NS0）对照组相比，各处理中排泄物腐生菌的相对丰度均增加，而木质腐生菌相对丰度除在施氮肥施秸秆（NS）处理组增加外，在其他各组中呈降低趋势；未定义腐生菌相对丰度在氮肥减施10%（N1S）、氮肥减施20%（N2S）和氮肥减施30%（N3S）处理组中呈增加趋势，其他各组中呈降低趋势；土壤腐生菌相对丰度在氮肥减施10%（N1S）、不施氮不施秸秆（N0S0）和氮肥减施30%（N3S）处理组中呈增加趋势，其他各组中呈降低趋势；植物寄生物相对丰度在不施氮不施秸秆（N0S0）、氮肥减施10%（N1S）和氮肥减施30%（N3S）处理组中呈增加趋势，其他各组呈降低趋势；植物病原菌相对丰度在不施氮肥施秸秆（N0S）和施氮肥施秸秆（NS）处理组中呈增加趋势，其他各组呈降低趋势；但这些功能基因相对丰度在各处理间的变化均不显著。

图7 土壤样品功能基因预测分析Fig.7 Predictive analysis of functional genes in soil samples

3 讨论

3.1 秸秆还田条件下氮肥减施对土壤真菌相对丰度影响

土壤微生物是土壤各项生态功能的重要参与者，土壤微生物的丰度及多样性可灵敏反映土壤环境的变化，在农业生态系统中，土壤真菌是分解有机物质和土壤生物量重要的组成部分[20]。已有大量的研究[21-22]表明，土壤真菌丰度随着秸秆还田条件下氮肥减施用量的减少而增加，即合理减施氮肥能促进土壤真菌的生长。研究发现，秸秆还田条件下，被孢霉属（Mortierella）、Solicoccozyma 和unclassified_Fungi为优势菌属，不施氮肥施秸秆（N0S）处理组被胞霉属相对丰度显著高氮肥减施20%（N2S）和氮肥减施30%（N3S）；不施秸秆，常规施用氮肥（NS0）Solicoccozyma 相对丰度分别显著高于不施氮不施秸秆（N0S0）、施氮肥施秸秆（NS）和氮肥减施10%（N1S）；氮肥减施20%（N2S）处理组unclassified_Fungi 相对丰度分别显著高于不施氮不施秸秆（N0S0）、不施氮肥施秸秆（N0S）、施氮肥施秸秆（NS）、氮肥减施10%（N1S）和不施秸秆常规施用氮肥（NS0），表明减施氮肥能够提高部分优势菌属的相对丰度。相关研究[23]表明，土壤微生物的研究主要集中在20 cm 以上土层中，微生物的生物量会随着土层深度的增加逐渐下降，故微生物多样性研究主要集中在20 cm 以上的土壤。研究发现，秸秆还田条件下氮肥减少施土壤真菌群落物种多样性显著高于CK，这与前人研究结果有所差异。分析研究差异，总结有两方面原因，一方面可能是土壤由于秸秆中纤维素、半纤维素、木质素等有机物的输入，从而促进了真菌的生长[24]，另一方面秸秆还田增加了土壤稳定性，改良了土壤结构，提高了土壤团聚体结构水平，从而为真菌的生长创造了良好的条件[25]。

3.2 秸秆还田条件下氮肥减施对真菌多样性的影响

多样性指数是评价土壤微生物群落丰富度和多样性的重要指标，ACE 指数和Chao1 指数表征微生物群落丰富度；Shannon 指数和Simpson 指数表征微生物群落多样性。研究中氮肥减施20%（N2S）、氮肥减施30%（N3S）处理，生物多样性（ACE、Chao1 指数）显著高于不施秸秆，常规施用氮肥（NS0）对照组；氮肥减施20%（N2S）处理组Simpson 指数显著高于常规施用氮肥（NS0）对照组，其余各处理间未与对照达到显著水平，即长期秸秆还田条件下，减施氮肥对土壤真菌多样性影响显著。Peng 等[26]研究表明，秸秆提供的高能碳和营养源会支持微生物生长，增加微生物生物量，秸秆还田会使土壤C/N 升高，因此施用尿素有利于降低土壤中的C/N 比，使土壤中的氮磷钾元素得到有效补充，有利于增加微生物数量、提高微生物活力[27]。

3.3 秸秆还田条件下氮肥减施对真菌群落结构的影响

连续多年秸秆还田条件下氮肥减施可以改变微生物群落结构[10]，但秸秆还田量及氮肥施入量不同对其影响也不同。土壤类型很大程度上决定了土壤真菌群落的结构，郑学博等[28]研究发现，沼液全氮（30%）处理会显著改变土壤微生物区系组成。真菌可以通过产生多种细胞外解聚酶，从而对作物秸秆进行分解。研究发现，秸秆还田条件下氮肥减施土壤真菌门水平上，子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、被胞霉门，unclassified_Fung 相对丰度较高，子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）作为腐生菌对复杂化合物分解起到重要作用，能够有效分解植物残体和降解秸秆残留物[29]。氮肥减施30%（N3S）处理组中子囊菌门（Ascomycota）的相对丰度显著高于不施秸秆常规施用氮肥（NS0）对照组；氮肥减施20%（N2S）处理组unclassified_Fungi 相对丰度分别显著高于对照与其他处理，不同秸秆还田氮肥减施处理土壤微生物群落组间差异极显著（P＜0.01）。Li 等[30]研究发现土壤真菌群落多样性随腐解时间的增长而显著提高，Penicillium sp.、Aspergillus sp.和Acremonium sp.是分解水稻秸秆的主要真菌。研究中未定义腐生菌、木质腐生菌、排泄物腐生菌、土壤腐生菌、植物寄生物、植物病原菌、植物腐生菌、内生植物、真菌寄生菌和动物病原菌等功能基因相对丰度较高，优势菌为未定义腐生菌和土壤腐生菌，在氮肥减施30%群落结构增加较多，这与辛励等[31]研究结果一致。

4 结论

秸秆还田条件下减施氮肥显著增加真菌OTU 值和真菌群落的多样性，在土壤真菌门水平上与对照相比较，子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、被胞霉门，unclassified_Fung；相对丰度较高，未定义腐生菌、木质腐生菌、排泄物腐生菌、土壤腐生菌、植物寄生物、植物病原菌、植物腐生菌、内生植物、真菌寄生菌和动物病原菌等功能基因相对丰度较高，减施氮肥20%（N2S）与减施氮肥30%（N3S）对增加真菌OTU 值，真菌ACE 指数和Chao1 指数，增强腐生菌作用尤为显著。