lncRNA RMRP 通过JAK/STAT 信号通路在子宫内膜癌细胞增殖和凋亡中的作用研究

方秋满,邓青春,周小飞,黄从妹 （海南医学院第二附属医院妇科，海南 海口 570311）

子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，近年来发病率呈上升趋势。目前，由于治疗技术的不断进步，早期子宫内膜癌患者的预后良好。然而，许多子宫内膜癌患者在确诊时已是晚期，而现有的治疗措施对此类患者无效，导致5 年生存率较低[1]。因此，探索子宫内膜癌的分子发病机制并寻找更有效的治疗靶点，对改善子宫内膜癌的治疗效果具有重要意义。随着分子生物学和基因诊断技术的快速发展，越来越多的证据表明，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）与癌症的发生发展密切相关，可作为肿瘤的特异性生物标志物[2]。研究证实，lncRNA 在子宫内膜癌中存在差异表达，并参与子宫内膜癌发生发展的多种恶性过程[3-4]。近期有研究报道，线粒体处理RNA 的内切酶复合物RNA 组分（RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease，RMRP）参与调控乳腺癌、食管癌等多种恶性肿瘤的进展[5-6]。然而，lncRNA RMRP 在子宫内膜癌中的作用及机制尚不明确。有研究报道，在子宫内膜癌中，Janus 激酶/信号转导与转录激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信号通路参与癌细胞的迁移、生长、凋亡及分化等进程[7]。因此，本研究分析lncRNA RMRP 在子宫内膜癌组织和细胞中的表达水平，探讨其是否通过调控JAK/STAT 信号通路参与子宫内膜癌的进展，并分析其相关分子机制，以期为子宫内膜癌诊断和治疗寻找新的生物标志物和潜在治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

正常子宫内膜细胞系HESC 细胞和子宫内膜癌细胞系HEC-1-A 细胞（中国科学院细胞研究所）；TRIzol®试剂（美国Invitrogen 公司）；PrimeScript®RT 试剂盒（日本Takara 公司）；CCK-8 试剂盒（美国Sigma-Aldrich 公司）；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；双荧光素酶报告基因试剂盒（北京普洛麦格生物技术有限公司）；兔抗人JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 单克隆抗体以及山羊抗兔IgG(H+L)二抗（美国Abcam 公司）；化学发光凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）；流式细胞仪（美国BD 公司）；酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；引物设计和合成委托上海生工生物完成。

1.2 方法

1.2.1 临床组织样本收集 纳入2021 年7 月至2022年3月在我院经组织活检和组织病理学分析确诊为子宫内膜癌的30例患者，在其接受手术治疗时收集子宫内膜癌组织标本，并在距离癌组织5 cm 处收集癌旁组织标本。纳入标准：①符合《子宫内膜癌诊断与治疗指南(第四版)》中子宫内膜癌的相关诊断标准，经子宫内膜组织活检和组织病理学分析确诊；②初次确诊；③生存期超过3 个月，且临床资料完整。排除标准：①接受过抗癌治疗，包括免疫抑制剂和/或性激素等相关治疗；②合并其他恶性肿瘤；③合并子宫肌瘤、子宫腺肌症等子宫良性疾病；④合并重要脏器疾病；⑤合并糖尿病和/或其他感染性疾病。本研究方案已由我院伦理委员会批准（202106-03）。所有入选患者均签署手术知情同意书。

1.2.2 细胞培养和转染 将正常子宫内膜细胞系HESC 和子宫内膜癌细胞系HEC-1-A 分别培养于RPMI-1640 培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和0.1 mg/mL 链霉素），置于恒温培养箱（37 ℃、5%CO2）中培养。将对数生长期的HEC-1-A 细胞（4×105个/孔）接种至24 孔板中，待细胞融合度达到80%时，根据Lipofectamine 2000 试剂说明书分别将空载体、pcDNA-RMRP、NC-siRNA、RMRP-siRNA、NC mimic、miR-580-3p mimic、pcDNA-RMRP+NC mimic、pcDNA-RMRP+miR-580-3p mimic、RMRP-siRNA+空载体、RMRP-siRNA+pcDNA-JAK2、NC inhibitor 和miR-580-3p inhibitor 转染至HEC-1-A 细胞中，分为空载体组、pcDNA-RMRP 组、NC-siRNA 组、RMRP-siRNA 组、NC mimic 组、miR-580-3p mimic 组、pcDNA-RMRP+NC mimic 组、pcDNA-RMRP+miR-580-3p mimic 组、RMRPsiRNA+空载体组、RMRP-siRNA+pcDNA-JAK2 组、NC inhibitor 组、miR-580-3p inhibitor 组，转染48 h 后收集细胞。

1.2.3 CCK-8 法检测细胞增殖率 将各组转染后的细胞以4×103个/孔的密度接种到96 孔板中，置于恒温培养箱（37 ℃、5%CO2）中培养。孵育0 h、24 h、48 h和72 h 后，分别加入10 μL CCK-8 溶液，然后放回恒温培养箱中继续孵育2 h。使用酶标仪测定450 nm 波长下的吸光度值。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 使用胰蛋白酶消化各组转染后的细胞，加入完全培养液重悬细胞，离心，弃上清。每个样本中加入Binding Buffer 重悬，然后加入5 μL Annexin V-FITC，在4 ˚C下避光染色15 min。然后加入5 μL PI，在4 ˚C 下孵育5 min。流式细胞仪上机检测，用FlowJo软件分析细胞凋亡率。

1.2.5 RT-qPCR 检测lncRNA RMRP、miR-580-3p 表达 使用TRIzol®试剂分离提取组织和细胞的RNA，然后在微量分光光度计NanoDrop 2000 上检测RNA 浓度以及OD260/OD280，如果OD260/OD280为1.8~2.0，可继续进行下一步实验。使用PrimeScript®RT 试剂盒将RNA 反转录为cDNA。随后使用SYBR Green 试剂盒在PCR 仪上进行PCR 扩增反应，反应条件为：95 °C 30 s，95 °C 5 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算基因表达水平。lncRNA RMRP 上游引物(5′-3′)：GCTGAAGGCCTGTATCCTAG,下游引物(5′-3′)：GCTCAGCGGGATACGCTTC；GAPDH 上游引物(5′-3′)：ATTTTGGAGGGATCTCGCTC,下游引物(5′-3′)：CAACGGATTTGGTCGTATTG；miR-580-3p 上游引物(5′-3′)：AAAATTTCCAATTGGAACC,下游引物(5′-3′)：AAGCAGGGTCCGAGGT；U6 上游引物(5′-3′)：GCTTCGGCAGCACATATAC,下游引物(5′-3′)：ATTTGCGTGTCATCCTTGC。

1.2.6 Western blot 检测JAK/STAT 信号通路蛋白表达 收集各组转染后的细胞，加入RIPA 裂解缓冲液提取总蛋白，在冰上操作。随后使用BCA 试剂盒检测蛋白样品浓度。制备SDS-PAGE 电泳分离胶及浓缩胶，将蛋白样品加入到凝胶孔中，进行恒压电泳，然后转移到PVDF 膜上。转膜结束后，将膜置于5%的脱脂牛奶封闭液中封闭1 h。然后加入一抗，在4 ℃冰箱过夜。PBST 洗膜3 次，每次5 min，加入二抗，室温孵育90 min。最后用ECL 化学发光液显影，用Image J 软件检测免疫印迹条带的灰度值，计算目标蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值。抗体工作液稀释度如下：兔抗人一抗JAK2（1:2 000 稀释）、p-JAK2（1:1 500 稀释）、STAT3（1:2 000 稀释）、p-STAT3（1:1 500 稀释），山羊抗兔IgG(H+L)二抗（1:5 000稀释）。

1.2.7 生物信息学分析 使用TargetScanHuman v7.2 网页版（https://www. targetscan. org/vert_72/）对lncRNA RMRP 与miR-580-3p 的直接序列互作位点、miR-580-3p与JAK2 3′-UTR的直接序列互作位点进行分析和预测。

1.2.8 双荧光素酶报告基因实验 使用双荧光素酶报告基因实验分别验证 miR-580-3p 与lncRNA RMRP、JAK2 3′-UTR 之间的靶向序列直接互作关系。将RMRP、JAK2 野生型（WT）或突变型（MUT）3'-UTR序列分别插入pGL3 载体中，构建lncRNA RMRP-WT或lncRNA RMRP-MUT、JAK2-WT 或JAK2-MUT 报告基因载体。按照说明书的方法使用Lipofectamine 2000试剂将lncRNA RMRP-WT 或lncRNA RMRP-MUT、JAK2-WT 或JAK2-MUT 与NC mimic 或miR-580-3p mimic共转染至细胞中。48 h后收集细胞，使用双荧光素酶报告系统检测相对荧光素酶活性。

1.3 统计学方法

使用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。所有数据以均数±标准差（）表示，Studentt检验用于分析2组间的差异，单因素方差分析用于多组间比较，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA RMRP 在子宫内膜癌组织和细胞中的表达

RT-qPCR 实验显示，与癌旁组织比较，lncRNA RMRP在子宫内膜癌组织中的表达显著升高（P<0.05），见图1a。与HESC细胞比较，lncRNA RMRP在HEC-1-A细胞中的表达显著升高（P<0.05），见图1b。以上研究结果提示，lncRNA RMRP 可能参与了子宫内膜癌的发生发展。

图1 lncRNA RMRP在子宫内膜癌组织和细胞中的表达

2.2 过表达或敲低lncRNA RMRP 对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响

与NC-siRNA 组比较，RMRP-siRNA 组细胞中lncRNA RMRP的表达显著降低（P<0.05）；与空载体组比较，pcDNA-RMRP 组细胞中lncRNA RMRP 的表达显著升高（P<0.05），见图2a、b。CCK-8 和流式细胞术实验结果显示，与NC-siRNA 组比较，RMRP-siRNA 组细胞增殖率降低（P<0.05），细胞凋亡率升高（P<0.05）；与空载体组比较，pcDNA-RMRP 组细胞增殖率升高（P<0.05），细胞凋亡率降低（P<0.05），见图2c~f。以上研究结果表明，过表达lncRNA RMRP 可显著促进子宫内膜癌细胞增殖，抑制细胞凋亡；敲低lncRNA RMRP可显著抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。

图2 过表达或敲低lncRNA RMRP对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响

2.3 lncRNA RMRP靶向并调控miR-580-3p的表达

通过生物信息学软件发现，lncRNA RMRP 可能含有miR-580-3p 的潜在结合位点（图3a）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与NC mimic 组比较，miR-580-3p mimic 组lncRNA RMRP-WT 报告基因载体的荧光素酶活性显著降低（P<0.05），而lncRNA RMRP-MUT 报告基因载体的荧光素酶活性变化无统计学意义（P>0.05），见图3b。RT-qPCR 实验结果显示，与NC-siRNA 组相比，RMRP-siRNA 组miR-580-3p水平显著升高（P<0.05），见图3c；而与空载体组比较，pcDNA-RMRP 组miR-580-3p 水平显著降低（P<0.05），见图3d。以上研究结果表明，lncRNA RMRP 可靶向并负调控miR-580-3p的表达。

图3 lncRNA RMRP靶向并调控miR-580-3p的表达

2.4 miR-580-3p靶向并调控JAK2的表达

通过生物信息学软件预测发现，miR-580-3p 与下游靶基因JAK2 的3′-UTR 可能含有潜在的结合位点（图4a）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与NC mimic 组比较，miR-580-3p mimic 组JAK2-WT 报告基因载体的荧光素酶活性显著降低（P<0.05），而JAK2-MUT 报告基因载体的荧光素酶活性变化无统计学差异（P>0.05），见图4b。Western blot 实验结果显示，与NC mimic 组比较，miR-580-3p mimic 组细胞中JAK2 蛋白水平显著降低（P<0.05），见图4c；而与NC inhibitor组比较，miR-580-3p inhibitor 组细胞中JAK2 蛋白水平显著升高（P<0.05），见图4d。以上研究结果表明，miR-580-3p可靶向并负调控JAK2的表达。

图4 miR-580-3p靶向并调控JAK2的表达

2.5 lncRNA RMRP 通过靶向miR-580-3p 调控JAK/STAT信号通路

Western blot 结果显示，与空载体组比较，pcDNARMRP 组细胞中JAK2、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05），STAT3 蛋白表达水平变化则无统计学意义（P>0.05）；与pcDNARMRP+NC mimic 组比较，pcDNA-RMRP+miR-580-3p mimic 组细胞中JAK2、p-JAK2、p-STAT3 蛋白水平显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05），STAT3 蛋白表达水平变化则无统计学意义（P>0.05），见图5。以上研究结果表明，lncRNA RMRP 可能作为miR-580-3p的竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）激活JAK/STAT信号通路。

图5 lncRNA RMRP通过靶向miR-580-3p调控JAK/STAT信号通路

2.6 lncRNA RMRP 通过JAK/STAT 信号通路对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响

Western blot 结果显示，与NC-siRNA 组比较，RMRP-siRNA组细胞中JAK2、p-JAK2、p-STAT3蛋白水平显著降低（P<0.05），STAT3 蛋白表达水平变化无统计学意义（P>0.05）；与RMRP-siRNA+空载体组比较，RMRP-siRNA+pcDNA-JAK2 组细胞中JAK2、p-JAK2、p-STAT3 蛋白水平显著升高（P<0.05），STAT3 蛋白表达水平变化无统计学意义（P>0.05）；此外，与RMRPsiRNA+空载体组比较，RMRP-siRNA+pcDNA-JAK2 组细胞增殖率升高（P<0.05），细胞凋亡率降低（P<0.05），见图6。

图6 lncRNA RMRP通过JAK/STAT信号通路对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响

3 讨论

近年来子宫内膜癌的发病率持续上升。研究表明，lncRNA 可作为潜在的肿瘤标志物和治疗的新靶点[8]。lncRNA是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，不编码蛋白质，而是以RNA 的形式在不同水平（表观遗传调控、转录调控、转录后调控等）调控基因表达。随着临床和细胞实验的深入研究，lncRNA 已被证明是一种具有多种生物学功能的非编码RNA，其在细胞增殖、分化、凋亡以及肿瘤的发生发展中起重要作用[9]。之前的研究已经揭示了lncRNA 在子宫内膜癌中的关键作用。例如，lncRNA TTN-AS1 通过靶向miR-376a-3p/PUM2 轴促进子宫内膜癌细胞增殖和转移[10]。lncRNA RHPN1-AS1 通过激活ERK/MAPK 通路促进子宫内膜癌进展[11]。RMRP 位于人染色体9p13.3上，由10 个不同的亚基和1 个RNA 分子组成，共有277 个nts，其广泛参与调控肿瘤的发生发展。lncRNA RMRP 通过靶向miR-206 促进膀胱癌细胞侵袭、迁移和增殖[12]。lncRNA RMRP 通过miR-613/NFAT5 轴促进非小细胞肺癌细胞的侵袭、迁移和增殖[13]。然而，lncRNA RMRP 是否在子宫内膜癌中发挥作用尚不清楚。本研究发现，lncRNA RMRP 在子宫内膜癌组织和细胞中的表达均显著升高；进一步功能实验显示，过表达lncRNA RMRP 可显著促进子宫内膜癌细胞增殖，抑制细胞凋亡；反之，敲低lncRNA RMRP 可显著抑制子宫内膜癌细胞增殖，促进细胞凋亡。以上研究结果提示，lncRNA RMRP 与子宫内膜癌的进展密切相关，可能成为诊断和治疗子宫内膜癌的潜在靶点。

ceRNA 假说揭示了一种全新的基因表达调控模式，lncRNA 可作为ceRNA 与miRNA 相互作用参与下游靶基因的调控，通过ceRNA 假说可以更好地理解基因调控网络在肿瘤发生发展中的作用。例如，lncRNA SNHG16 可作为ceRNA 调控miR-520/VEGF 轴促进肺癌细胞的迁移[14]。基于这一理论，越来越多的研究表明，lncRNA RMRP 可以通过海绵化miRNA 来影响肿瘤的发生和进展，如miR-206、miR-1-3p、miR-613 等已被鉴定为各种类型癌症中lncRNA RMRP 的作用靶点[15-17]。研究报道，lncRNA RMRP通过调控miR-580-3p/MICU1信号通路提高卵巢癌对紫杉醇的敏感性[18]。然而，lncRNA RMRP 是否海绵化miR-580-3p在子宫内膜癌中发挥作用尚不清楚。本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实了lncRNA RMRP 与miR-580-3p 靶向结合；进一步实验表明了miR-580-3p 的表达与lncRNA RMRP 的表达呈负相关。以上研究结果表明lncRNA RMRP可靶向并负调控miR-580-3p的表达。

JAK/STAT信号通路是经典的致癌信号通路，可诱导癌细胞迁移、生长和分化[19]。各种配体（如细胞因子）与细胞表面受体的结合引起受体分子二聚化，从而使得与受体偶联的JAK 相互接近，然后通过酪氨酸残基上的相互磷酸化激活JAK，活化的JAKs 磷酸化STATs 的酪氨酸残基并导致STATs 活化，参与肿瘤进展的调控[20]。研究表明，JAK/STAT 信号通路，尤其是JAK2 和STAT3，可通过提高c-myc 水平刺激细胞增殖[21]。JAK2/STAT3 信号通路作为经典的致癌信号通路，在调控子宫内膜癌进展中发挥着重要作用[22]。本研究双荧光素酶报告基因实验结果显示，JAK2 为miR-580-3p的潜在靶点；进一步研究发现，miR-580-3p可负向调控JAK2 的蛋白表达。本研究还揭示了lncRNA RMRP 对JAK/STAT 信号通路的调控作用，lncRNA RMRP 过表达后JAK2、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平显著升高，而miR-580-3p mimic 处理细胞后可逆转lncRNA RMRP 对JAK/STAT 信号通路的调控作用；功能实验进一步表明，lncRNA RMRP 敲低显著抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，而JAK2 过表达显著逆转了这一结果。虽然大量lncRNAs被认为是子宫内膜癌的诊断和预后标志物以及治疗靶点，但由于子宫内膜癌发病机制复杂，更多参与子宫内膜癌的分子机制还有待进一步探索。

综上所述，本研究表明敲低lncRNA RMRP 通过靶向miR-580-3p 和调控JAK/STAT 信号通路抑制子宫内膜癌细胞的增殖，促进细胞凋亡。这一研究结果阐明了lncRNA RMRP/miR-580-3p/JAK/STAT 轴与子宫内膜癌进展的关系，提示了lncRNA RMRP 在子宫内膜癌治疗中的潜在价值，为子宫内膜癌的治疗提供了新的治疗靶点和新思路。