血清miR-155、miR-23b 在特发性肉芽肿乳腺炎和乳腺癌中的差异性表达及意义

何 姣,周瑜辉,马晓霞,齐 晶 （西安交通大学第一附属医院乳腺外科，陕西 西安 710061）

特发性肉芽肿乳腺炎（idiopathic granulomatous mastitis，IGM）是一种罕见的慢性良性乳腺炎症疾病，其病因不明，临床和影像学表现与乳腺癌（breast cancer，BC）相似[1-2]。关于IGM 的诊断和治疗是临床探讨的热点，其常通过病理组织活检确诊[2-3]。但是穿刺病理检查在不同病程患者中难度不一，且创伤较大，费用昂贵，诊断周期长，因此，研究非侵入性的方法和分子进行早期诊断十分必要。微小RNA（microRNA，miRNA）是内源性的小而高度保守的单链非编码RNA，存在与mRNA 互补的序列片段，其作用是减少mRNA 的表达[4-5]。循环miRNA 是一种稳定存在于多种体液中的分子，由于其具有高稳定性、可靠性和可反映肿瘤状态的能力，可能成为癌症生物标志物[6]。目前有研究探讨了一些miRNAs 在BC 发病机制中的作用[6-8]，如miRNAs 表达改变会影响癌症进展，然而其是否会引起肿瘤抑制或致癌活性等仍存在争议[9-10]，且miRNA 在IGM 中的诊断价值也有待进一步探索。因此，本研究探讨既往文献报道的7 种BC 相关miRNAs（miR-155[6]、 miR-16-5p[7]、 miR-23b[8]、 miR-21-5p[9]、miR-210-3p[11]、miR-222-3p[12]和miR-29c-3p[13]）作为血清标志物诊断IGM 和BC 的价值，以期为IGM 的诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2018年10月至2021年11月我院收治的IGM患者32例和BC 患者40例；另外纳入33例具有相匹配的人口统计学特征的健康女性作为对照组。纳入标准：年龄大于18岁的女性患者；微生物培养阴性；经组织病理学检查证实为IGM 或BC；首次诊治，无BC 或IGM 史；既往未接受过化疗或放疗；具有完整临床、实验室、影像学相关资料。排除标准：有其他恶性肿瘤史、糖尿病、高血压、肾或心血管疾病；处于妊娠或哺乳期；真菌、寄生虫等感染，结节病，异物性肉芽肿，肉芽肿性多血管炎，巨细胞动脉炎及结节性多动脉炎；有肺结核或肺外结核、结核病感染者接触史、硅胶乳房植入及近期破伤风疫苗接种。本研究由我院医学伦理委员会批准（2018-00376），并根据《赫尔辛基宣言》进行，获得所有研究对象的知情同意。

1.2 方法

收集所有研究对象的临床资料，包括年龄，BMI，肝功能、肾功能等生化参数[血糖（glucose，Glu）、尿素（urea，Ure）、肌酐（creatinine，Cr）、丙氨酸氨基转移酶（alanineamino transferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartateamino transferase，AST）、白蛋白（albumin，ALB）、总蛋白（total protein，TP）]，炎症标志物[C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）]，血细胞分析[白细胞计数（white blood cell count，WBC）、血红蛋白（hemoglobin，Hb）、红细胞比容（hematocrit，Hct）、血小板计数（platelet count，PLT）]，肿瘤标志物[癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、CA15-3、CA125]。所有检测均由对研究终点不知情的实验室技术人员进行。

1.3 血清miRNAs水平检测

禁食12 h 后，收集各组患者的静脉血，3 000 r/min离心15 min。将血清转移到无RNase/Dnase的ependorf管中，于-80 ℃保存。使用TRIzol试剂（美国Invitrogen）提取总RNA，使用TaqMan miRNA 逆转录试剂盒试剂（美国Applied Biosystems）获得cDNA。在StepOnePlus实时PCR 系统（美国Applied Biosystems）上使用TaqMan Universal Master Mix Ⅱ和UNG 试剂（美国Applied Biosystems）对每个样本进行3 次定量PCR：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环。将定量数据归一化为对照cel-miR-39，并采用2-ΔΔCt法计算。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 统计学处理

采用SPSS 26.0 统计软件处理数据。首先对连续变量进行Kolmogorov-Smirnov正态性检验，正态分布的连续变量以均数±标准差（）表示，进行单因素方差分析和两两LSD-t检验。分类变量以率（%）表示，使用χ2检验。使用Pearson相关系数法评估相关性。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估血清miR-155、miR-23b 对IGM 和BC 的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料比较

3 组CRP、WBC、Hb、Hct、CA19-9、CA15-3、CA125水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）。IGM 组血清Hb、Hct 水平低于对照组，同时CRP、WBC、CA19-9 和CA125 水平高于对照组（P<0.05）。BC 组血清肿瘤标志物CA19-9、CA15-3、CA125水平高于对照组（P<0.05），CRP、WBC低于IGM组（P<0.05），见表2。

表2 3组临床资料比较（）

表2 3组临床资料比较（）

*：与对照组相比，P<0.05；#：与IGM组相比，P<0.05

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2.2 血清miRNAs变化

实时荧光定量PCR 结果显示，IGM 组患者血清miR-155、miR-16-5p、miR-21-5p、miR-210-3p、miR-222-3p、miR-29c-3p 表达水平高于对照组，血清miR-23b 表达水平低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.001）；BC组患者血清中以上miRNAs 表达水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.001），见图1。进一步比较BC 组和IGM 组发现，只有血清miR-155 和miR-23b 水平存在统计学差异，其中BC 组患者血清miR-155表达水平低于IGM 组（P<0.001），miR-23b 表达水平高于IGM 组（P<0.001），其余miRNAs 未见统计学差异（P>0.05），见图1。

图1 miRNAs相对表达

2.3 ROC曲线分析

血清miR-155和miR-23b水平鉴别诊断IGM 和BC的ROC曲线下面积（area under the curve,AUC）分别为0.722（95%CI：0.601～0.843）、0.765（95%CI：0.657～0.874），敏感度分别为81.00%、77.50%，特异度分别为65.00%、59.40%。二者联合鉴别诊断IGM 和BC 的AUC为0.869（95%CI：0.786～0.951），敏感度和特异度分别为84.10%和92.50%，见图2。

2.4 相关性分析

IGM 组患者中血清miR-155 与WBC（r=0.529，P=0.002）、CRP（r=0.589，P<0.001）水平均呈正相关，而血清miR-23b 与WBC（r=-0.444，P=0.011）和CRP（r=-0.495，P=0.004）水平均呈负相关，与其他指标未见明显相关性（P>0.05），见图3。

图3 IGM组血清miR-155、miR-23b与WBC、CRP的相关性分析

3 讨论

IGM是一种罕见的良性乳腺疾病，复发率高，治疗较为棘手，严重影响患者的生活质量[1-2]。IGM 的临床和影像学表现与BC 相似，需经组织病理学检查才能鉴别，但是不同病程患者中穿刺病理检查难度不一，且为有创检查，费用高，诊断周期长，因此，临床亟需一种可以快速且有效诊断的非侵入性检查方法。近年来，无创生物标志物和miRNA 芯片等技术不断出现，有助于IGM 与BC 的鉴别诊断。本研究通过评估几种BC 相关的血清miRNAs 表达水平，结果显示，血清miR-155 和miR-23b 具备鉴别诊断IGM 和BC 的潜力。

miR-155 已被证明可调节BC 细胞凋亡、增殖、侵袭和转移[14]。Anwar等[15]检测了BC 患者和健康女性血清miR-155 的表达水平，结果显示，BC 患者血清miR-155 表达上调。Khalighfard 等[16]研究发现，BC 组患者miR-155表达显著高于健康对照组，并与BC 的临床病理学特征存在相关性。本研究中BC 组患者miR-155 表达明显高于对照组，与上述研究一致，提示miR-155 与BC 发生密切相关；而IGM 组患者miR-155表达高于BC 组，分析其原因，IGM 中miR-155 的进一步上调可能与IGM 免疫炎症反应有关。miR-155 作为自身免疫性疾病密切相关的miRNA 之一，可通过Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）配体、炎症细胞因子和特异性抗原在多种免疫细胞谱系中上调[17]。miR-155介导的多种免疫相关靶点在哺乳动物免疫中具有不同的作用，包括参与B 细胞功能的调控，调节初始CD4+T 细胞向辅助性T 细胞（T helper cell，Th）1、Th2、Th17和调节性T细胞（regulatory cell，Treg）分化等[18-19]。Zhang 等[20]也发现，miR-155 在小鼠乳腺炎中具有促炎作用，其表达水平升高伴随着血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β 和TLR2 的产生，同时也可促进核因子活化B 细胞-κ 轻链增强子（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和MAPK磷酸化。以上研究提示，miR-155可能通过调节免疫和炎症反应介导IGM的发生。

miR-23b 是一种新的潜在自身免疫调节分子，参与多种疾病的发生和发展，包括肿瘤和自身免疫性疾病[8,21-23]。有研究表明，BC 患者中miR-23b 升高，可能是通过促进肿瘤生长、增殖和转移发挥癌基因的作用[8]。Papadaki 等[24]研究发现，转移性BC 患者循环miR-23b 表达水平较高，且与预后不良有关。本研究结果显示，BC 组患者miR-23b 表达水平明显高于对照组，提示miR-23b 与BC 的发生密切相关；而IGM 组患者中miR-23b表达显著低于BC 组和对照组，这可能是自身免疫性炎症反应引起。据报道，miR-23b 可能通过靶向转化生长因子β 激活激酶1-结合蛋白2（TAK1-binding protein 2，TAB2）、TAB3 和NF-κB 抑制物激酶α，抑制NF-κB 信号通路，从而抑制关键促炎细胞因子IL-17、IL-1β 和TNF-α 的分泌，抑制自身免疫炎症反应[21-22]。miR-23b 对NF-κB 信号通路的抑制作用在乳腺炎动物模型中也已得到证实[23]。以上研究提示，miR-23b 可能通过介导免疫性炎症反应影响IGM 的发生。

除了血清miR-155、miR-23b外，本研究BC组和IGM组患者miR-16-5p、miR-21-5p、miR-210-3p、miR-222-3p、miR-29c-3p 表达水平均较对照组显著升高，提示这些miRNAs 与BC 和IGM 的发生有关；但进一步比较BC组和IGM 组，这些miRNAs 均未见统计学差异，因而不能用于BC 和IGM 的鉴别诊断。我们推测上述miRNAs 在IGM 和BC 中的共同上调可能是由于IGM和BC 都与免疫异常、激素水平异常和炎症反应有关。虽然IGM 的确切病因尚不清楚，但其是一种自身免疫性炎性疾病的假说已经得到了流行病学、临床表现、免疫抑制治疗效果以及血清学和组织病理学等多方面的证据支持[25-26]。如Ling等[26]通过GO 和KEGG 富集分析表明，IGM的发生和发展可能与自身免疫性炎症、代谢和致病微生物有关。此外，有研究发现，Th、Treg和相关细胞因子是介导IGM 发病的关键介质[27]。本研究中，IGM 组患者血清WBC和CRP水平明显高于对照组和BC 组，提示IGM 与炎症相关；且IGM 组中血清miR-155 表达与WBC、CRP 水平呈正相关，而miR-23b与WBC、CRP 水平呈负相关，推断miR-155 和miR-23b作为重要的自身免疫调节分子可能在IGM 的发病机制中发挥着重要作用，这也是其作为IGM 和BC 鉴别诊断标志物的理论基础。本研究中ROC曲线分析显示，miR-155 和miR-23b 联合鉴别诊断IGM 和BC 的AUC、敏感度及特异度均较高，提示除了组织病理学和影像学表现外，血清miR-155和miR-23b有望成为IGM和BC鉴别诊断的靶标。

综上，血清miR-155 和miR-23b 有助于区分IGM和BC，有潜力成为IGM和BC早期鉴别诊断的靶标。