5-氟尿嘧啶温热化疗对人胰腺癌Panc-1细胞株的促细胞凋亡作用研究*

徐 鹏，林明伟，董功航，张建兴，郝 俊

1.深圳市中西医结合医院肝胆外科，广东 深圳 518104；2.深圳市中西医结合医院体检科，广东 深圳 518104；3.深圳市中西医结合医院甲状腺乳腺外科，广东 深圳 518104；4.深圳市中西医结合医院胃肠外科，广东 深圳 518104

胰腺癌占全部恶性肿瘤的1%～2%，早期难以发现，发现时多已属于晚期。转移率高，手术率低，仅10%～20%的患者能做根治手术，术后复发率高达80%以上。死亡率高，1 年生存率不到10%，5 年生存率低于4%，晚期胰腺癌中位生存期仅为3 个月左右［1］。胰腺癌侵犯周围脏器或脱落的癌细胞种植于腹膜，这是复发转移的根源，治疗上不仅要清除病灶及可能受侵的淋巴结，还应完全杀灭脱落的癌细胞。持续腹腔热灌注化疗（HIPEC）是一种用于肿瘤的温热化疗方案，是充分混合化疗药物与热灌注液后在恒温状态下持续循环地直接灌注到腹腔内，综合机械灌洗、化疗、热疗等作用，持续一段时间后直接消除肿瘤患者在恶性肿瘤根治术后腹腔中残留的癌性病灶，或者局部杀灭腹腔中已转移的癌性病灶［2］。研究［3-4］表明，在恶性肿瘤根治术中实施HIPEC 化疗可在极大程度上降低腹腔、盆腔中肿瘤的播散率，提升患者的总生存率。为提升HIPEC 化疗在肿瘤临床中的使用价值，需对其在肿瘤具体治疗中加强研究，如探索在腹腔内温热化疗中有效局部加热的问题，以求局部温热化疗更具合理性、安全性。本研究建立HIPEC 化疗对胰腺癌细胞体外作用模型，探究5-FU HIPEC 化疗下促进胰腺肿瘤细胞凋亡的作用，并探寻HIPEC 在胰腺癌Panc-1 细胞株凋亡过程中所发挥抗癌细胞协同作用的机制与热疗的最佳温度，为胰腺癌化疗提供依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

本研究采用的人胰腺癌细胞系Panc-1来源于中山医科大学附属肿瘤医院的分子生物学实验室。5-氟尿嘧啶（5-FU）与二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma-Aldrich公司，DMEM 高糖细胞培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素与链霉素购自美国Gibco公司，Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Invitrogen生命技术公司。器械包括台式高速离心机（型号TGL16G）、生物洁净工作台（型号BCM-1OOOA 型）、CO2细胞培养箱（型号BNA-311 型）、雪花制冰机（产自日本三洋公司，型号SIM-F124）、超纯水制造系统（型号Mi1i-Q）、流式细胞仪（型号Epics-XL2型）、微量加样器（产自德国Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养方法 在无菌培养瓶接种人胰腺癌细胞株Panc-1，后加入含有100 mg/mL 链霉素、100 μ/mL 青霉素、10%胎牛血清的DMEM 高糖培养液，之后将其放置在细胞培养箱，提前设置培养温度为恒温37 ℃、相对湿度为95%、CO2浓度为5%，培养瓶松盖培养48 h，达到对数生长期。使用浓度为0.25%的胰蛋白酶消化液进行消化，3 min后终止反应，行吹打操作，将其制备成单细胞悬液，每毫升准确计数，其中细胞浓度为1×105个/mL，备用［5］。

1.2.2 5-FU 工作浓度的设定 5-FU 工作浓度使用既往实验结果，浓度为500 μg/mL。

1.2.3 实验分组 本次共划分为4 组，即空白对照组、化疗组、热疗组、温热化疗组。通过嵌套式的设计，设置每组的处理方式。空白对照组以37 ℃处理，但不使用5-FU化疗药，化疗组使用5-FU 处置，药物浓度为500 μg/mL，热疗组则使用不同温度进行温热处置，而温热化疗组既使用5-FU处置，浓度500 μg/mL，又使用不同温度进行温热处置。其中，热疗组与温热化疗组不同温度均为40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃、45 ℃。

1.2.4 实验各组处理方法 在6 孔无菌培养板中接种Panc-1细胞，达到对数生长期后，在培养板上设立空白对照组、实验组，其中3 孔作为一个平行样本。在进行实验前将原有的培养基除去，据实际情况分组，并实施相对应的处置方案。不同组别处置方式不同。（1）空白对照组：将2 mL 培养液加入至每个培养孔中，并使用恒温培养箱培养24 h，其中37 ℃为生理温度。（2）化疗组：每个培养孔中加入2 mL 含5-FU 培养液，其中化疗药浓度500 μg/mL，后放置在培养体系中培养。Panc-1 细胞与5-FU 的接触时间是24 h。（3）热疗组：每个培养孔中加入2 mL 培养液，之后分别放置在细胞培养箱中，培养条件为相对湿度95%、CO2浓度5%，而温度为40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃、45 ℃（由CO2细胞培养箱进行温控调节，且允许有±0.1 ℃的误差），均孵育60 min。热疗完毕后，将其继续放置在培养体系中培养23 h。（4）温热化疗组：每个培养孔中加入2 mL 含5-FU 培养液，其中，化疗药浓度500 μg/mL，即刻将其分别放置在细胞培养箱中，培养条件为相对湿度95%、CO2浓度5%，而温度为40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃、45 ℃，均孵育60 min。热疗完毕后，将其继续放置在培养体系中培养23 h。

1.3 实验指标

（1）细胞凋亡率检测。处置完毕后，4 组的细胞均使用Annexin V/PI 双标记法及配套细胞凋亡试剂盒进行检测。判断标准：流式细胞术所测得的散点图中，右上的第一象限为晚期坏死细胞与凋亡细胞，表示（＋＋）；左上的第二象限为死亡细胞，表示（—＋）；左下的第三象限为活细胞，表示（——）；右下的第四象限为早期凋亡细胞，表示（＋—）。胰腺癌细胞株Panc-1 细胞凋亡率取第一象限与第四象限检测到的凋亡率之和。上述实验组均为3 个复孔，细胞凋亡率的最终结果是3 个复孔的平均值。（2）热疗和化疗联合作用的观察。选取热疗组、化疗组与温热化疗组，按照Veleriote 法对热疗联合化疗的相互作用进行判定。其中，［C］=［E］为相加作用，［C］＞［E］为协同作用，［D］＞［C］＞［H］为干扰作用，［E］＞［C］＞［D］或者［E］＞［C］＞［H］为次加作用。上述符号释义：热疗组细胞凋亡率为［H］，化疗组细胞凋亡率为［D］，温热化疗组细胞凋亡率为［C］，热疗与化疗联合预估细胞凋亡率为［E］。计算公式为［E］=［H］+［D］-［H］×［D］［6］。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t 检验。计数资料以例数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 热化疗增敏效应情况

5-FU 促胰腺癌细胞株Panc-1 细胞凋亡时，对温度有较强的依赖性，在温度为40～45 ℃时，促凋亡作用会伴随温度升高而增强。促凋亡作用在温度为43～45 ℃时骤然增强，且在温度为45 ℃时，促凋亡作用达到最大。在温度为43～45 ℃时，温热化疗组相比于化疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在温度为40～42 ℃时，温热化疗组相比于化疗组，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1、图1～4。

图1 对照组（37 ℃）凋亡流式细胞散点图

图2 5-FU化疗组（500 μg/mL）凋亡流式细胞散点图

图3 温热组（45 ℃）凋亡流式细胞散点图

图4 温热化疗组（43 ℃、500 μg/mL）凋亡流式细胞散点图

表1 温热化疗对人胰腺癌Panc-1细胞的促凋亡作用（±s）

表1 温热化疗对人胰腺癌Panc-1细胞的促凋亡作用（±s）

注：P1值为温热化疗组与热疗组相比较，P2值为温热化疗组与化疗组相比较。

组别化疗组温热化疗组P2值37 ℃0 13.6±0.52 40 ℃0.50±0.32 16.54±0.67＞0.05 41 ℃0.54±0.32 16.67±1.18＞0.05 42 ℃0.82±0.14 17.83±1.26＞0.05 43 ℃2.10±0.33 20.12±0.32＜0.05 44 ℃5.07±0.32 23.34±1.31＜0.05 45 ℃13.52±0.40 28.10±2.67＜0.05 P1值＜0.05

2.2 促人胰腺癌Panc-1细胞凋亡率情况

温热化疗组人胰腺癌Panc-1细胞凋亡率大于预估凋亡率，温热化疗呈协同作用，见表2。

表2 促人胰腺癌Panc-1细胞凋亡率情况 %

3 讨论

目前，胰腺癌化疗、放疗是临床除去手术之外疗效显著的两大手段。有研究［7］表明，诱导癌细胞凋亡是化疗药遏制癌症病灶生长的作用机制之一，但诱导癌细胞凋亡与否已成为抑制癌生长能力判断的重要指标。胰腺癌化疗的常用药物5-FU 可增强胰腺癌细胞凋亡机制。HIPEC 结合温热疗法与腹腔化疗的优势，在治疗胰腺癌及复发转移方面疗效独特，温热化疗会影响胰腺癌肿瘤细胞骨架、细胞膜、大分子合成及DNA修复机制，同时，温热化疗还会促进癌细胞产生大量的溶酶体，激活溶酶体酶的活性，从而抑制癌生长能力，促进癌细胞凋亡率加快［8］。

3.1 温热化疗对癌细胞具杀伤作用

本研究结果表明，温热化疗是改善疗效、促细胞凋亡的有效方案。但单一热疗仍存在一定问题，即温度过高会导致人体正常细胞受损，且极易导致部分癌细胞出现耐热性，因而不适合单一应用。因此，在胰腺癌患者化疗配合体内热疗时，既需要关注温度过低导致疗效受影响的问题，又需要避免过高的温度导致人体正常细胞受损，或导致癌细胞出现耐热性的问题［9］。

3.2 温热化疗对化疗具增敏效果

本研究分析发现，在5-FU 药物浓度相同的情况下，在温度为40～45 ℃时，各组促凋亡作用均高于37 ℃空白对照组。促凋亡作用在温度为43～45 ℃时骤然增强，且在温度为45 ℃时促凋亡作用达到最大，结果表明热疗对化疗具增敏效果。当热疗温度超过40～45 ℃时，人体难以耐受，会损伤正常细胞。在5-FU 药物浓度相同的情况下，温热化疗组杀伤胰腺癌细胞株Panc-1细胞的作用明显强于热疗组，究其原因为热度既能将胰腺癌细胞直接杀伤，又可进一步提升癌细胞胞浆中5-FU 的药物浓度，以此强化5-FU 的促细胞凋亡作用［10］。热化疗增强化疗药杀伤效果的这一特点在肿瘤临床上具有显著意义，一是热化疗可增强癌细胞或耐药癌细胞对化疗药的敏感性，改善疗效；二是热化疗可明显降低化疗药物的实际用量，大幅度减弱因化疗所产生的毒副作用［11］。

3.3 温热化疗增敏程度

本研究依据Veleriote 法对温热化疗的作用进行判定发现，在温度为41～45 ℃时，其呈现为协同作用，且相比于热疗加化疗的促细胞凋亡作用，温热化疗的作用更显著。在温度为43～45 ℃时，相比于化疗组，温热化疗组的促细胞凋亡作用更强，在温度为40～43 ℃时，温热化疗的热增敏效果更加明显，且在温度为43～45 ℃时，温热化疗的协同作用明显，证实在温度为43～45 ℃时，5-FU HIPEC 的促胰腺癌细胞凋亡的效果佳。因此，对临床实际情况充分考虑后，建议43 ℃可作为最佳温度［12］。

3.4 温热化疗作用原理

（1）胰腺癌属于厌氧肿瘤，因其对放疗、化疗的敏感性偏低，但临床实验发现其对温热的敏感性偏高，而HIPEC 化疗正是利用胰腺癌细胞、正常组织细胞两者间温度耐受性的差异而实施的［13］。正常组织细胞可耐受高温，温度为45 ℃，而在温度为40～43 ℃时，癌细胞或癌症病灶会受温度影响导致相关功能缺乏，难以散热，进而导致肿瘤细胞被灭活、凋亡［14］。（2）热疗与腹腔灌注化疗的作用相互协同。HIPEC 的化疗方式能在极大程度上催化5-FU 与胰腺癌细胞DNA 两者间的加聚反应，进一步提升癌细胞对5-FU 的敏感性，强化5-FU 促胰腺癌细胞的凋亡伤作用，且温热化疗在极大程度上对化疗后癌细胞的DNA修复加以抑制。除此之外，在温度为43 ℃时，能进一步将肿瘤细胞膜的稳定状态破坏，增加5-FU 的渗透深度，从既往的1～2 mm 延伸至5 mm，以此大幅度提升肿瘤细胞中化疗药物的浓度［15］。（3）在药代动力学方面HIPEC化疗的优势明显。腹腔内化疗的给药方式可促使腹腔中5-FU 的血药浓度维持在较高水平，减低外周血药浓度。故而，HIPEC 化疗既可强化5-FU 对腹膜表面转移癌的直接细胞毒性作用，又可大大降低胰腺癌患者的全身毒副作用［16-18］。（4）高浓度5-FU 经过肝门静脉吸收后进入肝脏，对于晚期胰腺癌患者已转移至肝脏的癌细胞及癌栓具有较强的杀伤作用［19］。（5）胰腺癌患者HIPEC 过程中，利用灌注液子阿腹腔中持续流动循环效果，对腹腔中游离的胰腺癌细胞、腹膜上种植转移癌细胞发挥机械性冲刷的作用，以此进一步清除胰腺癌患者腹腔中微小转移灶及残留的癌细胞。

综上所述，5-FU HIPEC 化疗具有促胰腺癌Panc-1 细胞株凋亡的作用，43 ℃是温热化疗协同作用的最佳温度。