宫颈癌组织中DACT2启动子甲基化与宫颈癌细胞侵袭和转移的关联

谢 旭

南阳市第一人民医院妇科，河南 南阳 473000

宫颈癌是最常见的癌症之一，是女性癌症死亡的第三大原因。越来越多的研究［1］表明，长期感染高危人类乳头瘤病毒（HPV）、HPV16、HPV18 等是宫颈癌患者的主要组成部分。事实上，并不是所有的转移性宫颈癌患者都被诊断为HPV感染，这表明许多不确定因素可能导致宫颈癌的开始和发展。尽管手术结合放疗和/或化疗已经取得进展，但部分宫颈癌患者出现原发肿瘤侵袭和早期转移，导致预后不良，治疗效果不佳［2］。因此，阐明宫颈癌转移的分子机制非常重要。

通过筛选与Wnt 信号中枢的散乱蛋白相互作用的蛋白，研究者分离出了β-环连蛋白抑制基因（DACT）支架蛋白家族，包括DACT1、DACT2 和DACT3。DACT 又名Dapper／Frodo，DACT 家族最初是在非洲爪蟾中发现的，其能够结合Dsh 并且稳定β-catenin 降解复合物。DACT 编码可以调节细胞间信号通路的脊椎动物细胞内蛋白，根据以往的报道，DACT 蛋白在不同的肿瘤类型中都具有抑制肿瘤的作用［3］。此外，在肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌等部分原发肿瘤和肿瘤细胞系中发现DACT1 和DACT2 表达下降和启动子高甲基化，但在宫颈癌组织中DACT2的基因启动子甲基化作用机制尚不清楚［4］。在本研究中，研究者试图检测DACT2 在宫颈癌组织中的作用和甲基化状态，并阐明其与宫颈癌细胞侵袭和转移的关联性，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2020 年1 月—2022 年3 月在南阳市第一人民医院就诊的60 例宫颈癌患者作为观察组，再选择同期60 例健康体检者作为对照组。纳入标准：经组织病理学检查均确诊为宫颈癌且均首次确诊，此前未通过任何方式进行治疗，患者临床资料完整。排除标准：处于妊娠期或者哺乳期，除宫颈癌之外患有其他各种恶性肿瘤，患有宫颈妇科炎症，由于各种原因无法配合完成本次研究。本研究获得医院医学伦理委员会的批准，并提供了参与研究的知情同意书。术后采集其宫颈癌组织及配对正常相邻宫颈癌组织，立即用液氮保存，宫颈癌及癌旁正常组织切片均于医院病理科取得。

1.2 方法

1.2.1 半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时荧光定量RT-PCR 检测mRNA 表达 根据试剂盒的使用说明书，使用Trizol 试剂从组织中分离总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度法评价RNA 的质量和数量，其中引物按照RT-PCR 试剂盒说明书中推荐完成选择，以甘油醛—3—磷酸脱氢酶（GAPDH）基因作为内对照。对于PCR 产物在2%琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化乙锭染色显示，并使用图像分析系统进行定量。采用Stepone Plus 热循环仪和SYBR 绿色PCR Master Mix 进行实时PCR 反应，目的基因表达量采用2-△△CT 法，用GAPDH 归一化，每个样品重复进行3 次上述反应［5］。

1.2.2 DACT2免疫组化观察 采用亲和素—生物素复合物免疫过氧化物酶免疫染色法检测组织中DACT2、DACT 表达。阻断内源性过氧化酶和非特异性反应后，用兔抗人多克隆抗体DACT2（1∶100稀释）孵育载片，然后用生物素化二抗和ABC 试剂孵育，以3,3’—二氨基联苯胺为显色剂，苏木精反染，阴性对照用非免疫血清代替一抗作为阴性对照，以DACT2染色阳性的载玻片为阳性对照。DACT2表达按照评分方法进行评估，评分与阳性细胞的强度和百分比有关［6］。

1.2.3 甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）和亚硫酸氢盐基因组测序（BGS）分析DACT 甲基化 用DNAzol 组织中分离总DNA，用蛋白酶K 消化法从组织中制备基因组DNA。基因组DNA 用Epitect Fast 亚硫酸氢盐转换试剂盒完成相关处理，未甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢钠处理后可转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能转化，仍然是胞嘧啶。基于亚硫酸氢钠处理后甲基化和非甲基化等位基因的DNA 序列电位差，研究者设计了MSP 引物来分析DACT2的区域。DACT2的甲基化状态在包含转录起始点位区域内测定，用2%琼脂糖凝胶和溴化乙锭对MSP产品进行分析，并在紫外照明下进行可视化。基因组DNA 使用CpG 甲基转移酶处理，作为阳性对照，以水空白为阴性对照。为保证质量控制，对每个样品进行重复甲基化分析。针对BGS，设计了用于识别亚硫酸氢钠转化DNA 的引物，纯化BGS PCR产物的目的片段，克隆到pGEM-T载体上，每个标本的10个克隆进行荧光自动测序［7］。

1.3 观察指标

统计宫颈癌患者的病理特征，包括年龄、肿瘤大小、FIGO 分期、有无细胞转移以及宫颈浸润深度；根据1.2 方法检测宫颈癌组织、癌旁组织和正常组织的DACT2去甲基化发生率、DACT2 mRNA 和蛋白表达水平；采用Pearson检验法，分析DACT2启动子甲基化与宫颈癌细胞侵袭和转移的关联性，其中检验水准为α=0.05。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验。计数资料以例数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌患者的病理特征

宫颈癌患者的病理特征中分期、有无细胞转移以及宫颈浸润深度所占百分比比较，差异有统计学意义（P＜0.05），而年龄和肿瘤大小比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 宫颈癌患者的病理特征（n=60）

2.2 DACT2去甲基化发生情况

宫颈癌组织、癌旁组织和正常组织中DACT2去甲基化发生率分别为45.00%、6.67%和5.00%，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 DACT2去甲基化发生情况

2.3 DACT2 mRNA和蛋白表达水平

宫颈癌甲基化组DACT2 mRNA 和DACT2 蛋白表达水平低于宫颈癌非甲基化组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 DACT2 mRNA和蛋白表达水平（±s）

表3 DACT2 mRNA和蛋白表达水平（±s）

组别宫颈癌甲基化组宫颈癌非甲基化组t值P值DACT2 mRNA 0.78±0.14 1.54±0.19 11.332 0.001 DACT2蛋白1.13±0.19 2.38±0.26 8.543 0.001

2.4 DACT2 启动子甲基化与宫颈癌细胞侵袭和转移相关性分析

相关性分析结果表明，DACT2启动子甲基化是引发宫颈癌细胞侵袭和转移的因素，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 DACT2启动子甲基化与宫颈癌细胞侵袭和转移相关性分析结果

3 讨论

DACT 家族蛋白最初在爪蟾中被发现。人类DACT 家族有3个成员，DACT1、DACT2和DACT3的编码基因分别位于人类14q22.3、6q27 和19q13.32 染色体上。此前的研究［8-9］表明，人类DACT 在人类癌症中经常是沉默的，例如DACT2 基因所在的6q 染色体的缺失是人类肿瘤中最常见的染色体畸变之一，除了缺失外，DACT 的表观遗传修饰也被报道。例如有报道称［10］DACT1 和DACT2 在肝细胞癌、口腔鳞状癌、胃癌、鼻咽癌、甲状腺癌、结肠癌和肺癌中被甲基化，此外，DACT3在甲状腺乳头状癌中被发现有组蛋白修饰［11］。DACT2 在宫颈癌中的功能和表达调控在很大程度上是未知的。

采用RT-qPCR 和Western blot 方法检测DACT2 启动子甲基化在宫颈癌组织中的表达情况。结果表明，宫颈癌组织、癌旁组织和正常组织中DACT2去甲基化发生率分别为45.00%、6.67% 和5.00%。同 样 的，有 研 究［12］发 现，DACT2在乳腺癌组织和细胞系中经常处于沉默状态，对这些DACT2 沉默的乳腺癌组织和细胞系的MSP 分析表明，DACT2 启动子高甲基化，且乳腺癌细胞中DACT2 的丢失主要是由于DACT2 启动子区域的甲基化。DACT2 基因编码的Dapper2 蛋白对Wnt 通路具有较强的抑制作用，可通过对Wnt 通路中的Dishevelled 因子相互作用并促进其降解，来减弱由GSK3β、Axin 等组成的降解复合物对通路中心因子β-catenin 的降解，以抑制该信号通路的活化，从而抑制肿瘤的发生发展。

此外，本研究结果还发现，宫颈癌甲基化组DACT2 mRNA 和蛋白表达水平低于宫颈癌非甲基化组。相关性分析结果表明，DACT2启动子甲基化是引发宫颈癌细胞侵袭和转移的因素。同样有研究［13］用细胞生长曲线法评价DACT2 对乳腺癌细胞增殖的影响，用Transwell 法评价DACT2 对癌细胞侵袭能力的影响，发现DACT2 过表达可抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭，而DACT2 启动子甲基化可促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭。目前的数据表明，DACT2 在乳腺癌中发挥肿瘤抑制因子的作用。DNA 甲基化是一种主要的表观遗传机制，涉及甲基转移到C5 碳残基的胞嘧啶（5mC），由一个DNA 甲基转移酶家族介导DNA 甲基化在多种生物学过程中发挥重要作用，包括基因表达调控、基因组印记、细胞分化、发育和炎症异常甲基化，大多数DACT2 均是未甲基化的，这些DACT2 的高甲基化是肿瘤细胞中常见的改变之一，可能导致肿瘤抑制基因的沉默［14］。而DACT2 基因在肺癌细胞中被高甲基化，一些研究已经报道甲基化标记比蛋白质标记更敏感，因此，癌症特异性甲基化标记在临床上用于准确诊断癌症有很大的潜力［15-16］。

综上所述，宫颈癌细胞侵袭和转移主要影响因素就是DACT2 启动子甲基化，且DACT2 启动子甲基化率越高，细胞侵袭和转移程度就越高。因此，临床应密切监测患者DACT2启动子甲基化情况，有助于优化宫颈癌患者的治疗方案。此外，本研究提示DACT2启动子甲基化可能促进了乳腺癌的进展，这也为乳腺癌的治疗提供了一个有希望的治疗靶点。