miR-145基因多态性与脑梗死的关系及对miR-145水平的影响*

黄艳云,陆青兰,韦必晓,杨丽娜,黄荣透

广西壮族自治区百色市人民医院检验科,广西百色 533000

脑梗死(IS)是一种致残率高、致死率高的复杂性脑血管疾病,微小RNA (miRNA)在其发病与进展过程中发挥了关键性的作用[1]。作为一种基因转录后的调控因子,miRNA能够调控目标mRNA的表达从而介入多种生命活动如细胞生长、分裂、衰退或发育等[2]。miRNA被广泛视为多种癌症的抑制因子,其在肿瘤生长发育、凋亡、侵袭和转移中起着关键作用[3-4]。此外,miR-145也被证明是血管平滑肌细胞最丰富的miRNA,其水平相对较小的变化会显著影响血管稳态,与动脉粥样硬化相关疾病的发生和发展密切相关[5-7]。以往的诸多研究结果表明,miR-145在IS患者中表达失衡,其异常表达在IS病理学中起着至关重要的作用,或将成为IS的生物标志物和(或)治疗目标[8-12]。但导致miR-145在IS中表达失衡的分子机制尚不清楚。单核苷酸多态性(SNP)可能是miR-145调控的重要因素。已有多项研究表明,miR-145基因SNP与多种疾病的易感性有关,并影响miR-145的表达[5,7,9,13]。鉴于此,本研究筛选了miR-145基因中次要等位基因频率较高且与多种疾病易感性有关的rs41291957、rs353291位点,探讨其与IS的关系,并评估miR-145在IS患者中的表达及其与这2个位点SNP之间的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 从2021年1-12月在本院神经内科住院患者中筛选出253例初次确诊为IS的患者,其中男153例、女100例,平均年龄(63.4±11.1)岁。IS诊断符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》中的相关诊断标准,并经过临床、实验室及射影像学等一系列检查综合确诊。另选取同期在本院体检中心体检的275例健康者作为对照组,其中男147例、女128例,平均年龄(61.9±9.5)岁。两组性别、年龄比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。排除标准:脑出血、颅内感染、肿瘤、自身免疫性疾病和传染类疾病;患严重影响肝、肾、心功能的疾病。这些个体都是非亲缘关系的广西地区人口。本研究经本院医学伦理委员会批准。所有研究对象均对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1收集标本 收集所有研究对象清晨空腹静脉血3～5 mL(EDTA-K2抗凝),用于基因组DNA提取和单个核细胞的分离。所有标本存储于-70 ℃冰箱备用。

1.2.2基因组DNA提取和分析 使用由重庆中元汇吉生物技术股份有限公司供应的核酸提取试剂盒(磁珠法)进行全血基因组DNA检测,并严格按照说明书操作。在完成DNA样本提取后使用紫外分光光度计检测其质量和浓度。

1.2.3引物的设计与合成 利用NCBI搜索含有rs41291957、rs353291位点的长度适宜的DNA片段,然后使用Prime 3.0软件为这些片段设计引物,并将其交给北京擎科生物科技公司来生产,而探针引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列信息如表1所示。

表1 rs41291957、rs353291引物序列信息

1.2.4rs41291957、rs353291位点多态性检测 采用TaqMan探针法荧光定量PCR检测。PCR扩增反应体系为上、下游引物各0.4 μL,探针引物0.2 μL,2×AceQ qPCR Probe Master Mix(Vazyme)10 μL,DNA模板1 μL,加双蒸水至总体积20 μL。按照上述体系完成加样后,把加好样品的反应板置于德国Analytik Jena qTOWERE 2.2荧光定量PCR仪中进行反应。PCR循环参数:95 ℃预变性反应3 min,然后40个循环(95 ℃变性15 s,56 ℃复性15 s,72 ℃延伸20 s)。反应结束后根据扩增曲线的峰型和信号强度并结合人工校验进行基因型判断,以保证试验结果的准确性。

1.2.5外周血单个核细胞中miR-145水平的检测 利用Trizol技术从外周血单个核细胞中提取总RNA,提取产物使用紫外分光光度计评估其纯度,如果A260/A280落在1.9～2.1,则该RNA样本满足实验要求。接着,采用由宝生物工程(大连)公司提供的试剂盒来检测基因mRNA的表达水平。然后采用反转录试剂盒(Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit,Takara)将RNA合成为cDNA,再根据cDNA 2 μL、SYBR Advantage Premix 12.5 μL、正向及反向引物各0.5 μL、ROX Dye 0.5 μL、去离子水9 μL的比例进行PCR。使用相对定量分析2-ΔΔCt法计算miR-145相对表达水平。

1.3观察指标 (1)比较IS组和对照组rs41291957、rs353291位点多态性分布情况。(2)比较IS组和对照组miR-145水平。(3)分析rs41291957、rs353291位点不同基因型研究对象的miR-145水平。

2 结 果

2.1两组rs41291957、rs353291多态性遗传平衡评估 IS组和对照组rs41291957、rs353291的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律的要求(P>0.05),具有群体代表性。见表2。

表2 两组rs41291957、rs353291多态性Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果

2.2不同性别研究对象miR-145基因rs41291957、rs353291多态性分布情况比较 IS组和对照组中,不同性别间rs41291957、rs353291基因型及等位基因的分布频率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组不同性别研究对象miR-145基因rs41291957、rs353291多态性分布情况比较[n(%)]

2.3IS组和对照组miR-145基因rs41291957、rs353291多态性分布情况比较 rs41291957、rs353291位点的基因型频率和等位基因频率在IS组与对照组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 两组间rs41291957、rs353291多态性分布情况比较[n(%)]

2.4IS组和对照组miR-145水平比较 IS组患者外周血单个核细胞中miR-145水平为4.68±1.02,显著高于对照组的2.70±0.83,差异有统计学意义(P<0.001)。

2.5miR-145基因rs41291957、rs353291位点不同基因型miR-145水平比较 对IS组或对照组进行组内分析,rs41291957和rs353291位点各基因型之间miR-145水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 miR-145基因rs41291957、rs353291位点不同基因型miR-145水平比较

3 讨 论

IS被确定为一种复杂的脑血管疾病,受各种环境和遗传因素的影响。SNP是人类基因组中最常见的遗传变异类型。位于miRNA中的SNP被称为miRSNPs,这种miRSNPs可能通过改变自身的转录翻译过程或对miRNA-mRNA的相互作用施加影响来发挥作用,从而影响个体患病的风险[14-15]。目前已有多个miRSNPs被证明与IS风险密切相关[16-17]。近年来的研究发现,miR-145基因rs41291957和rs353291 SNP不仅与慢性肾脏疾病[18]、腹主动脉瘤[19]等多种疾病的易感性相关,而且与动脉粥样硬化、冠状动脉疾病的风险相关[5,7]。由于IS的重要病理学基础是动脉粥样硬化,因此,miR-145的 rs41291957、rs353291位点SNP可能在IS发生中起作用。为此,本研究在广西人群中进行了二者之间的相关性研究。本研究结果显示,miR-145基因rs41291957、rs353291位点在IS组和对照组中均存在AA、AG、GG 3种基因型,且这2个位点在IS组和对照组中的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。这表明所选择的研究样本可以有效地反映这2个SNP位点存在于目标人口的情况,具有群体代表性,且这种多态性在群体中不存在性别间的差异。但是rs41291957和rs353291的基因型频率和等位基因频率分布在IS组与对照组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05),提示miR-145 rs41291957和rs353291多态性不会影响广西人群IS发病。与上述研究结果相比,本研究结果未发现这2个SNP与IS易感性有关联,可能的原因是本研究与上述研究的疾病和人群不同。即便同一种疾病,也会因研究人群的不同导致结果不一致。不同的地理、种族群体因遗传背景相差较大,往往具有独特的遗传易感性位点。例如,WEI等[9]报道,miR-145基因rs4705342 TC/CC基因型与中国南方汉族人群IS风险降低相关;然而,ZHU等[20]报道,rs4705342 SNP与中国北方汉族人群IS风险无关。

近几年多项研究结果发现,miR-145在IS患者中差异表达与IS的发生密切相关,miR-145有望成为一种新的无创的特异性生物标志物来识别IS[8,11]。本研究数据也显示,IS组患者外周血单个核细胞中miR-145水平显著高于对照组,这与以往的研究结果一致,支持miR-145可能是新一代IS预测指标的观点。目前,关于miR-145与IS的研究主要集中在miR-145水平及其调控机制上,但导致其在IS中表达失调的分子机制鲜有研究。SNP可能是miR-145调控的重要因素。已有多项研究表明,miR-145基因rs41291957、rs353291位点与多种疾病的易感性相关,并影响miR-145的表达。例如,HALL等[5]研究发现,rs41291957 A等位基因的存在与成熟miR-143和miR-145水平显著增加有关,并影响冠状动脉疾病的发病风险。另有研究报道,与miR-145 rs353291 TT基因型的个体相比,C等位基因携带者对动脉粥样硬化的易感性增加且miR-145水平降低[7]。这些研究结果表明,miR-145基因rs41291957、rs353291位点与miR-145水平之间存在明显的基因型、表型相关性。然而遗憾的是,本研究在对IS组或对照组进行组内分析时,这2个位点各基因型之间miR-145水平差异均无统计学意义(P>0.05),提示rs41291957和rs353291位点SNP对miR-145的水平不具有调节作用。本研究结果与其他研究结果相反,这可能是同一个SNP在不同疾病中调控机制不同的原因,miR-145在IS中异常表达可能是其他分子机制引起的。

综上所述,本研究进一步确认miR-145在IS患者外周血单个核细胞中水平升高,为其作为IS潜在的生物诊断标志物提供了支持。但是,miR-145基因rs41291957、rs353291位点多态性与IS易感性不存在关联性,且对miR-145水平也不具有调节作用。基因多态性在不同种族及地理人群间存在异质性,本研究只针对广西地区人群,该结论可能不适用于其他种族和其他地区群体。现阶段的文献中几乎没有涉及miR-145基因rs41291957、rs353291多态性与IS遗传风险之间关联的研究报告,两者之间是否有关联,还需要更多的数据支持,包括从更多地域和民族背景的人口或者更大规模的团队中收集信息。