趋化因子配体25、叶酸受体1在结直肠癌中的表达及与临床病理特征、预后的关系

王盼，杨秀春

作者单位：北京市平谷区中医医院，a普外科，b外科，北京101200

结直肠癌（CRC）的发病率逐年上升［1］。大部分病人确诊治疗时病情已发展至中晚期阶段，错过最佳治疗时机，病人预后效果不理想，且目前临床缺乏能够准确评估病人预后的指标，因此，寻找能够有效评估CRC病人预后的生物学指标具有重要的临床意义［2-3］。趋化因子配体25（CCL25）可一定程度反应机体炎症程度，机体内主要参与刺激炎症分子和免疫细胞分化、增殖和凋亡等生理过程［4］。近年来研究发现，趋化因子表达与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关［5］。CCL25体内主要存在于小肠上皮细胞和胸腺，其表达水平与CRC、非小细胞肺癌和卵巢癌等多种肿瘤疾病发展密切相关［6］。叶酸受体1（FOLR1）是一种膜蛋白，参与调节机体细胞增殖、分化和迁移等生理过程［7］。研究发现FOLR1在多种肿瘤细胞增殖、分化等过程中异常表达，例如卵巢癌、肺癌、肝癌等［8-9］。目前CCL25和FOLR1在CRC发展过程中的研究鲜有报道。本研究对CRC病人CCL25和FOLR1水平与预后的关系进行分析，为临床中CRC的预后提供新的研究方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2014年10月至2019年8月北京市平谷区中医医院接收的CRC病人（70例）为研究对象（实验组），年龄范围为46～68岁；以同期到本院体检的35例健康者的血清样本作为对照组，年龄范围为48～65岁。纳入标准：（1）临床确诊为CRC；（2）术前未进行抗肿瘤治疗；（3）无其他并发症；（4）病人均知情同意；排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤；（2）合并血液相关疾病；（3）合并肝、肾等其他器官障碍者；（4）基础临床病理资料不全者。本研究经北京市平谷区中医医院伦理委员会审核批准（批号20140825）。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 采集CRC病人癌组织以及癌旁组织（距癌组织＞3 cm）。采集CRC病人术前和对照组体检时3～5 mL空腹静脉血，离心（3 500 r/min，10 min，半径8 cm）后，存储于-80 ℃。

1.2.2 酶联免疫吸附法 分别采用人趋化因子配体25（CCL25）ELISA试剂盒（合肥莱尔生物科技有限公司）、叶酸受体1（FOLR1）ELISA试剂盒（上海优科唯生物科技有限公司）检测血清CCL25和FOLR1表达水平，严格按照试剂盒操作说明进行检测。

1.2.3 免疫组织化学染色法 将组织进行脱蜡、水化、冲洗（PBS缓冲液）后，将抗原进行修复，玻片冲洗（PBS缓冲液，3次）后，依次加入CCL25和FOLR1的一抗，孵育过夜（4 ℃），冲洗（PBS缓冲液，4次）后加入生物素标记的二抗，放置45 min（室温），冲洗（PBS缓冲液，3次）后进行染色、复染、定色、脱水、封片。阳性病理切片为阳性对照，PBS缓冲液为一抗做阴性对照。

1.2.4 免疫组化结果判定 评分标准分为将着色强度和着色面积两个部分：（1）着色强度评分：棕褐色（3分）；棕黄色（2分）；淡黄色（1分）；无着色（0分）。（2）着色面积评分：占比＞75%（4分）；占比51%～75%（3分）；占比26%～50%（2分）；占比11%～25%（1分）；占比＜10%（0分）。将两部分评分相加，评估其阳性表达（≥3分）和阴性表达（＜3分）。

1.2.5 随访观察 对CRC病人进行为期3年的随访（电话及门诊复查），病人随访率为100%。

1.3 统计学方法 通过SPSS 25.0软件对数据进行分析，计数资料用例（%）描述，进行χ2检验，计量资料行描述，进行独立样t检验（组间）和配对样本t检验（组内），通过Kaplan-Meier法进行生存分析，CRC病人预后的影响因素通过多因素Cox回归进行评估。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料与血清CCL25、FOLR1的表达分析 相较于对照组，实验组病人血清CCL25和FOLR1水平较高，差异有统计学意义（P＜0.05），两组年龄、性别均差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 CRC病人70例与健康者35例一般资料与血清CCL25、FOLR1的表达水平分析

2.2 CRC组织和癌旁组织CCL25、FOLR1表达比较 通过显微镜观察结果显示，CRC组织中CCL25的阳性表达率（68.57%比21.43%）高于癌旁组织，CRC组织中FOLR1的阳性表达率（65.71%比25.71%）高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2，图1。

表2 CRC组织及癌旁组织中CCL25、FOLR1的表达情况/例（%）

图1 结直肠癌（CRC）组织及癌旁组织中趋化因子配体25（CCL25）、叶酸受体1（FOLR1）的表达（免疫组织化学染色×200）

2.3 CRC病人血清CCL25、FOLR1表达与临床病理特征的关系分析 选择病人年龄、肿瘤长径、瘤体类型、TNM分期、分化程度、淋巴结转移、浸润程度等临床病理特征进行分类，分析其病理特征与血清CCL25、FOLR1表达的关系。结果显示：CRC病人血清CCL25、FOLR1表达水平与淋巴结转移、TNM分期、浸润程度有关（P＜0.05）。见表3。

表3 血清趋化因子配体25（CCL25）、叶酸受体1（FOLR1）的表达与结直肠癌70例临床病理特征的关系/

表3 血清趋化因子配体25（CCL25）、叶酸受体1（FOLR1）的表达与结直肠癌70例临床病理特征的关系/

注：CCL25为趋化因子配体25，FOLR1为叶酸受体1。

病理特征年龄＜60岁≥60岁肿瘤长径＜3 cm≥3 cm瘤体类型溃疡型隆起型浸润型TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期分化程度低分化中、高分化淋巴结转移无有浸润程度未出肌层突出肌层例数CCL25/（µg/L）t（F）值1.04 P值0.302 FOLR1/（ng/L）t（F）值1.11 P值0.269 38 32 13.90±3.12 14.74±3.64 549.26±81.63 571.92±88.40 0.740.4651.890.063 34 36 13.94±3.72 14.61±3.90 538.84±85.84 579.24±92.42（0.30）0.742（0.59）0.556 23 18 29 13.88±3.20 14.74±3.35 14.31±3.89 544.48±86.90 560.65±84.69 570.98±89.25 3.96＜0.0013.330.001 37 33 12.59±3.48 16.18±4.11 525.96±86.50 597.37±92.67 0.860.3960.960.341 32 38 13.88±3.14 14.62±3.96 548.95±83.35 568.60±86.94 2.720.0083.060.003 35 35 13.08±3.22 15.48±4.10 529.10±74.55 590.14±91.74 2.950.0043.280.002 31 39 12.59±3.50 15.63±4.82 521.58±78.49 589.86±92.42

2.4 CRC病人血清CCL25、FOLR1表达与病人3年生存率的关系分析 分析CRC病人血清CCL25、FOLR1的表达与病人预后的关系，以CRC病人血清CCL25、FOLR1的平均水平值为临界点，CCL25≥14.28 µg/L为高表达组（32例），＜14.28 µg/L为低表达组（38例），FOLR1≥559.62 ng/L为高表达组（30例），＜559.62 ng/L为低表达组（40例）。结果显示CCL25高表达组的3年生存率（31.25%，10/32）低于低表达组（78.95%，30/38），FOLR1高表达组3年生存率（30.00%，9/30）低于低表达组（77.50%，31/40），差异有统计学意义（χ2=4.63、4.61，均P＜0.001）。

2.5 CRC病人预后影响因素的Cox回归分析 以CRC病人预后（死亡=1，生存=0）为因变量，TNM分期（Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1）、浸润程度（未出肌层=0，突出肌层=1）、淋巴结转移（无=0，有=1）、CCL25（具体值）和FOLR1（具体值）水平为自变量进行多因素Cox回归。结果显示，淋巴结转移、TNM分期、浸润程度、FOLR1和CCL25水平为CRC病人预后影响因素（P＜0.05）。见表4。

表4 结直肠癌病人预后影响因素的Cox回归分析

3 讨论

CRC是临床发病率较高的恶性肿瘤之一，其发生发展是一个多阶段、多基因的过程［10］。CRC发病原因复杂，存在多种内在和外在因素，例如家族史、慢性炎症、饮食习惯等［11］。CRC早期发病特征不明显，病人确诊时多数已发展为中晚期，临床常采用手术、化疗和靶向治疗等手段进行干预治疗，但由于缺乏特异性预后评估指标，CRC病人预后易发生转移、复发等不良现象，影响病人预后生活质量［12］。因此，寻找CRC预后评估的特异性指标对CRC病人预后生存率提高具有重要意义。

趋化因子是一类由70～100个氨基酸组成，可以趋化特定细胞定向迁移的低分子分泌蛋白［13］。CCL25属于趋化因子配体一员，为CCR9的唯一配体，多项研究表明CCL25与受体CCR9共同作用对多种肿瘤细胞的增殖和侵袭等具有促进作用［14］。研究发现，趋化因子诱导机体T细胞反应，从而影响肠癌微环境相关因子的分泌，进而导致机体肠道失衡［15］。徐辉等［16］研究趋化因子诱导T细胞对CRC微环境的影响，结果表明，与癌旁组织相比，CRC组织中趋化因子表达差异有统计学意义，趋化因子与CRC细胞浸润和肠道微生物群显著相关，趋化因子可刺激T细胞分泌至肿瘤组织，影响CRC病人的治疗及预后情况。本研究中，CCL25阳性表达率在CRC组织中较高，实验组病人血清CCL25表达水平显著高于对照组（P＜0.05），血清CCL25表达与TNM分期、淋巴结转移、浸润程度有关（P＜0.05），CRC病人血清CCL25低表达病人3年生存率（78.95%）显著高于高表达病人生存率（31.25%）（P＜0.05），CCL25水平为CRC病人预后影响因素（P＜0.05），提示CCL25表达水平与CRC病人病情发展密切相关，且影响病人预后生存率。

FOLR属于叶酸受体蛋白，人体叶酸代谢失调会导致机体免疫因子表达异常，引发染色体甲基化异常，与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关［17］。目前，FOLR主要包括FOLR1、FOLR2和FOLR3三种亚型，FOLR1在体内主要存在于细胞外膜，对叶酸存在较高的亲和力，通过其表达水平变化调节多种肿瘤细胞的增殖、分化和迁移等［18-19］。本研究中，FOLR1阳性表达率在CRC组织中较高，实验组病人血清FOLR1表达水平显著高于对照组（P＜0.05），血清FOLR1表达与TNM分期、淋巴结转移、浸润程度有关（P＜0.05），血清FOLR1低表达病人3年生存率（77.50%）显著高于高表达病人生存率（30.00%）（P＜0.05），FOLR1水平为CRC病人预后影响因素（P＜0.05），提示FOLR1表达水平与CRC病人病情发展密切相关，且影响病人预后生存率。

综上所述，CCL25、FOLR1在CRC病人中表达水平上升，并影响CRC病人预后生存率。