中性粒细胞胞外诱捕网在脓毒症病理生理及临床应用中的研究进展

王芸飞，李燕

作者单位：山西医科大学第二医院急诊医学科，山西 太原030001

脓毒症是由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍综合征［1］，世界各地有无数病人因此而过早死亡或面临长期残疾。由于是一种潜在感染引起的综合征，标准的全球疾病、伤害和风险因素负担研究（GBD）只能用来估计其风险与负担：2020年Lancet发布的脓毒症相关全球疾病负担报告中显示，2017年全世界估计有48.9万例败血症病例和11.0万例败血症相关死亡，占全球所有死亡人数的19.7%［2］。正因为这较高的发生率及可怕的病死率，2017年5月世界卫生组织（WHO）认定脓毒症为“全球医疗优先关注的疾病”。

自“脓毒症”这一概念提出以来，我们与之已经斗争了近30多年，但目前仍没有一种治疗方法可以持续、长期地挽救脓毒症病人的生命，其根本原因可能是脓毒症起源的异质性及与之伴随的病理生理机制的未知性。目前普遍认为脓毒症的病理学特征是炎症失衡和免疫抑制并存［3］。中性粒细胞是感染发生后的第一道防线，在早期到达感染或炎症部位，并通过吞噬、氧化爆发、脱颗粒和产生中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）等功能发挥抗感染、促炎等作用。骨髓粒细胞生成以50～100亿次/日来维持其周转。自从2004年Brinkman等［4］发现中性粒细胞通过挤压排出DNA-蛋白质结构形成NETs来捕获和杀死组织中的细菌以来，越来越多的研究探索NETs在脓毒症发生发展中的作用和机制，并由此提出许多临床治疗新方向。

1 产生机制

目前的研究发现，NETs的产生是感染过程中，中性粒细胞在外化其细胞内容物（即饰有抗菌蛋白和丝氨酸蛋白酶的DNA框架）的同时发生程序性细胞死亡，称为NETosis。早在人们对NETs形成机制有所认识之前，Urban、Backman［5］就通过蛋白质组学分析基本确定了其框架，即：以组蛋白（H）、DNA为主要成分（约70%），内含颗粒酶和多肽，如中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、抗菌肽（LL-37）、髓过氧化物酶（MPO）、组织蛋白酶G、白细胞蛋白酶3（PR-3）、乳铁蛋白、明胶酶、溶菌酶C以及钙卫蛋白等。一般来说，所有形式的NETosis都需要细胞内膜的重组，从而允许胞质内的各种酶和核内的DNA及组蛋白结合。综合最新的研究结果，NETs的产生可以分为自杀式的NETosis和保留生命的NETosis，也有实验发现这两者在刺激后有时间上的先后差别［6］，同时DNA组分可有线粒体或核DNA之分。

经典的（或自杀式的）NETosis，由实验时的典型代表佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13醋酸酯（PMA）或体内的病原相关模式分子（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）等激活，通过模式识别受体（如TOLL样受体TLR）、补体系统受体（CR）、Fc受体（FcγRIIA和FcγRIIIb）或细胞因子受体等膜受体识别，激活蛋白激酶C（PKC）及其下游的Raf-MEK-ERK通路（丝裂原活化蛋白激酶MAPK上游信号通路）和NADPH氧化酶2（NOX2）-活性氧自由基（ROS）通路，胞质中蓄积的ROS、Ca2+作为第二或第三信使激活肌动蛋白及制孔蛋白（如gasdermin D，GSDMD），协助胞质或噬天青颗粒中的NE、肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）、MPO或去乙酰化酶（HDAC）等入核，促进核染色质解缩，激活DNA酶并启动NETosis［6-12］。局部染色质重塑、组蛋白的表观遗传修饰是NETosis的先决条件［13］，最终以中性粒细胞死亡而收场。

近年来，研究发现了“保留生命的NETosis”，即一部分中性粒细胞（约10%）被刺激（如一定浓度的脂多糖）后，通过PRR传导信息，在被激活后约10 min挤出装载核DNA的囊泡而不破坏质膜，这一过程并不产生大量的ROS，最终产生NETs和保留了吞噬、迁移和趋化等能力的无核粒细胞［12］。以上反应中，解聚的核物质是如何在保持细胞整体形态的情况下装载、运输、释放到保外的，其机制仍有待进一步研究。以上差别可能是刺激强度的、胞内钙蓄积的浓度及氧化还原代谢状态有差异，才能在产生NETs、级联激活免疫反应的同时，保留中性粒细胞的吞噬和趋化能力，最大程度避免了强刺激下迅速的中性粒细胞解体［6］，延长了固有免疫的续航能力，为脓毒症免疫抑制研究提供了新思路。

随着研究的逐步深入，人们发现线粒体可能在ROS积累和钙蓄积环节有着不可替代的作用，甚至线粒体DNA可能是NETs中DNA骨架之一［7-8］。对斑马鱼的研究证实了DNA聚合酶γ、线粒体的DNA聚合酶（Polg）对中性粒细胞运动、线粒体ROS富集的影响［8］。同时，脓毒症发生时，小脑和海马中线粒体的呼吸链复合体连接发生异常，具体表现为复合体Ⅰ连接底物氧化、ADP刺激呼吸和呼吸受体控制率减少［7］。有研究发现中性粒细胞暴露于细菌后的5 min内发生的早期抗菌事件中，NETs的形成依赖于线粒体呼吸链复合体Ⅲ的功能［7-8］。此过程中糖酵解更加活跃，ATP/ADP或乳酸、磷酸烯醇式丙酮酸等糖酵解产物是否可以如信号分子一样发挥关键的激发甚至启动作用？线粒体在中性粒细胞的抗菌反应中发挥的作用具有广阔的研究潜力，这也可能将是未来研究突破的重要方向。

随着对NETosis研究的深入，人们发现刺激的异源性可能是产生机制多样化的根源：实验状态下由PMA刺激诱导，NETosis表现出相对固定的Raf-MEK-ERK和NOX2依赖的特性，而在复杂的内环境中不同种类及浓度的PAMPs和DAMPs带来丰富的可能性，研究者们尝试从脓毒症来源的异质性探究NETosis的节点，见表1。

表1 脓毒症来源异质性形成胞外诱捕网节点的研究

1.1 细菌与NETs 金黄色葡萄球菌是一种有较高发病率（北美人口中发病率约4.3～38.2例/100 000人年［14］）和病死率（10%～30%［14］）的病原体，一般认为其通过脂蛋白与TLR结合促进NETs形成。而最近一项研究发现，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌通过TLR-2/1诱导的NETosis并不依赖脂蛋白，此过程也不需要NOX2、ROS参与［15］。百日咳杆菌中Ig样凝集素（Siglec）-F可能是NETs生成的关键途径，并可以被IL-17增强。一项以肺炎克雷伯菌为研究对象的实验证明，革兰阴性菌以核苷酸结合的寡聚化结构域样受体（NLRP）6为上游驱动因子激活NETosis，而外源性重组趋化因子配体（CXCL1）可挽救NLRP6-/-的小鼠中性粒细胞的趋化、聚集、颗粒释放及NETs形成的能力［17］。

1.2 真菌与NETs 免疫受损病人机会性、侵袭性的真菌感染的发病率和病死率大大增加，是脓毒症的重要来源。既往普遍认为，真菌诱导的NETosis主要是与PMA刺激相似的ROS依赖的PKC途径［15］。越来越多的文献指出NETs在机会性真菌感染中的激活途径不是单一的，而是受病原体、感染部位和宿主免疫状态共同影响。如实验鼠中由CR3负责与调理后的白色念珠菌结合，由PRR（如Dectin-2）识别未调理的白色念珠菌。人类中性粒细胞则使用CR3识别未调理的白色念珠菌和烟曲霉菌［17］。关于烟曲霉菌的研究发现，嗜酸性粒细胞外陷阱的释放是通过CD11b和Syk酪氨酸激酶的溶解性非氧化机制实现的，依赖于Src家族、Akt、钙和p38-MAPK信号通路［18］。关于真菌刺激NETs产生的研究相对局限，有待进一步的研究。

1.3 病毒与NETs 以新型冠状病毒为典型代表的病毒感染因其多变的临床症状和严重程度给全球医疗系统带来巨大压力。一方面，目前的研究认为病毒普遍通过中性粒细胞表面PRRs诱导NETs形成，例如：①人类免疫缺陷病毒（HIV）通过TLR-7/8刺激中性粒细胞产生NETs；②呼吸道合胞病毒（RSV）在β2整合素参与下通过融合蛋白与TLR4结合诱导NETosis。另一方面，病毒也可以不通过PRRs依赖的途径诱导NETs形成，如通过炎性趋化因子和细胞因子如干扰素和白细胞介素（IL）-8或激活的血小板［19］参与NETs形成。在针对新冠肺炎的研究中发现，SARS-CoV-2引发的NETosis启动于病毒膜糖蛋白S与血管紧张素转换酶2（ACE2）［20］之间的分子相互作用，由丝氨酸蛋白酶（TMPRSS2）及PAD4参与下一步的代谢反应。该研究还发现ACE2与SARS-CoV-2导致的免疫抑制反应有关［20］。

1.4 寄生虫与NETs 随着社会经济文化水平的提高，寄生生物所致的疾病对于社会生活的影响逐渐减小，目前关于寄生因素与NETs形成及其机制的报道相对较少。一部分寄生虫具有出色的免疫抑制能力，可以躲避免疫细胞的抓捕，在体内潜伏感染数年之久。这能否为脓毒症后免疫功能紊乱特别是免疫抑制状态的研究提供新方向？蠕虫有独特的在人体中建立慢性、无症状感染的能力，最近一项研究尝试探讨以猪带绦虫为代表的蠕虫对于免疫反应的调节功能。Chauhan等［21］发现，中带绦虫（M.Corti）的排泄/分泌因子（称为寄生配体，PL）通过阻断电压依赖型离子通道TRPM2的激活、AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）和自噬来抑制ROS刺激下的NEYosis，PL是中性粒细胞功能的重要生物调节因子。另一项关于线状丝虫的研究发现，线状丝虫分泌的、均一的、含有磷酸胆碱的糖蛋白ES-62通过下调MyD88基因表达阻断TLR2/4接头-转导分子驱动的炎症反应［22］达到免疫逃逸的效果。寄生虫也能促进NETs的产生：疟原虫感染的红细胞释放巨噬细胞移动抑制因子（MIF），通过依赖于CXC趋化因子受体4（CXCR4）的机制引起PAD4介导的NETosis［20］。

1.5 活化的血小板与NETs 静息循环中，血小板是血液中的哨兵。血小板激活后，可以通过脱颗粒统一释放PAMPs，如高迁移率族蛋白1（HMGB1）、血小板因子4（PF4）和调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子（RANTES，如CCL5）等，与其在中性粒细胞上的配体结合间接促进NETs的形成［23］，也可以通过物理作用直接激活中性粒细胞。血小板-中性粒细胞直接结合是血小板驱动Netosis的重要环节。对于人类的研究发现，中性粒细胞表达的整合素MAC-1可以通过vWF因子与血小板异二聚体糖蛋白1ba（GP1ba）结合，是体外诱导NETosis的关键步骤［24］。

2 NETs的病理生理作用及其临床应用

急性感染期间，NETs可以通过限制传播、物理捕获和破坏分解等方式传播来发挥其抗菌活性，如表2。细胞外染色质表面的负电荷可以与白念珠菌和利什曼原虫等生物体结合［24］，组蛋白则以正电荷结合病毒包膜蛋白上的负电分子［19］。被吸附后的微生物会被高浓度的抗菌蛋白（如组蛋白、组织蛋白酶G、肠毒素、MPO等）杀死或灭活。此外，NETs也可以作为PAMAs，进一步激活抗炎反应，如前文所述HMGB1、PF4、CCL5和组蛋白等物质可以触发包括中性粒细胞本身在内的免疫细胞释放更多的细胞因子和趋化因子［25］。

表2 NETs组分的临床应用研究

然而，过度扩大的免疫反应伴随的往往是糟糕的病理结果。NETs的调节异常，无论是过度产生还是降解不足，都有可能带来组织损伤、高凝状态乃至血栓形成的严重后果，如与肺损伤相关的急性呼吸窘迫综合征和与凝血异常有关的弥散性血管内凝血均已被发现与NETs的过度产生有极大的关系［25］。组蛋白释放后可结合核苷酸结合寡聚化结构域2（NOD2）和免疫球蛋白结构域4（VSIG4）或核苷酸结合的寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3），进而激活胱天蛋白酶1（caspase-1）、制孔蛋白（GSDMD）引起细胞焦亡［27］。还可以通过补体发挥作用，引起包括脓毒症心肌病在内的一系列并发症。

NETs还是免疫血栓形成的重要启动物质，其结构成分可以直接激活血小板，促进血栓形成，并抑制纤溶和天然抗凝途径。血栓形成特别是脓毒症相关免疫血栓形成被认为是脓毒症不良结局的重要因素。从脓毒症病人身上收集的1.5～10.0 kbp的双链DNA大片段与Ⅻ因子和高分子量激肽原结合可以加强凝血反应。组蛋白可以通过TLR2和TLR4激活血小板并增加凝血酶的生成，诱导释放多磷酸［24］，暴露磷脂酰丝氨酸和激活V因子，这些变化反过来促进凝血酶原复合物的组装［30］。组蛋白还可以通过激活调节蛋白C，进一步发挥血栓前作用。在体外，组织蛋白酶G和NE可以降解人内皮细胞上的组织因子途径抑制物（TFPI）进一步增强凝血。DNA与纤溶酶和纤维蛋白形成三元复合物，改变血浆凝块中的纤维蛋白结构发挥抗纤溶作用。NETs还可以捕获TFPI，是唯一能有效抑制重要的蛋白水解酶复合体、Tf-FⅦa和凝血酶原酶活性的内源蛋白［31］。

随着NETs病理作用逐渐被肯定，其在临床诊疗过程中的应用也逐步被开发出来。对其组分浓度的监测使人们得以窥见脓毒症发生、恶化的趋势，特别是瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）、血清钙卫蛋白（S100A8/A9异源二聚体）等特异性相对较高的指标被发现可能是脓毒症诊断和预后的新型生物标志物［26，32］。Pan等［26］发现，CitH3对感染性急性胰腺炎（AP）和非感染性AP的诊断能力优于PCT，并提出CitH3浓度＞43.05 ng/L作为截断值区分病情严重程度和临床转归，曲线下面积（AUC）及其95%CI为0.93（0.86，1.00）。血清钙卫蛋白作为一种抗菌促炎蛋白复合体，占中性粒细胞胞质中可溶性蛋白的60%，被认为是诊断多种炎症性疾病的生物标志物［33］，基线浓度与脓毒症病人的总生存期成反比。NE2和CitH3，以及内皮衍生生物标志物Syndecan-1均被发现与脓毒症所致DIC相关［28］。Keir等［29］尝试探索以NETs的浓度指导静脉用药，发现病人在接受大环内酯类药物治疗后，NETs（如组蛋白-弹性酶复合体等）浓度与铜绿假单胞菌感染病人病情恶化的减轻有关。

目前NETs的检测主要是通过显微镜、ELISA、蛋白质印迹法、流式细胞术等方法，识别、命名和量化的不一致大大阻碍了临床应用，甚至出现了细胞组学高含量筛选（HCS）的新方法，这将大大促进NETs的相关研究及临床使用。

总之，NETs在早期控制和促炎反应方面发挥了局限、分解和促炎的重要作用，同时其过度产生也是过度炎症反应并发生免疫功能紊乱、器官功能障碍的重要环节。因此研究者们尝试通过抑制过度的NETs释放来改善脓毒症的病情进展和预后。

3 治疗新思路

由于NETs的过量产生在脓毒症病理过程中占有重要地位，因此，最近研究者们一直在努力寻找抑制NETs的形成或消除多余的NETs的潜在治疗方法，如表3。相关研究发现NETs聚集可能会加重脓毒症，同时阻塞胰管导致胰腺炎；而阻断NETosis已被证明可以改善症状和预后［34］。虽然NETosis随激活物质的变化存在有极大异质性，但丝氨酸蛋白酶途径（如Raf-MEK-ERK通路）、NOX2-ROS途径及核物质解聚的各种酶类（如NE、PAD4、MPO或去乙酰化酶等）都是相对统一、固定的，这也是近年来抑制NETs形成的研究热点。抑制不同的位点可能带来相似的效果。早期静脉注射氨甲环酸可能通过经典的NE/MAPK途径有效地抑制NETosis。针对PAD的研究发现抑制PAD2或PAD4均能显著减少脓毒症诱导的NETs成分［26］，Cl-脒抑制PAD4阻断组蛋白瓜氨酸化，进而阻止脂多糖（LPS）或PMA介导的NETosis。同样抑制HDAC也被证明可以治疗脓毒症：锌依赖赖氨酸脱乙酰酶是Ⅰ/Ⅱb类HDAC，是诱导NETosis所必需的，其抑制剂ricolinostat被证明可以在不影响其他抗炎反应的基础上，有效抑制NETs的过量释放，并已进入药物Ⅱ期临床试验［12］。另外第二代NE抑制剂Sivelestat已在日本和韩国用于与全身炎症反应相关的急性肺损伤（ALI）病人的临床应用，其新型载体ICMV（ICMV-SIVE）更容易被中性粒细胞吸收，可能具有更好的疗效［35］。

表3 脓毒症治疗新方案

传统医学也提供了新思路：姜酮治疗可抑制核因子2（Nrf2）介导的ROS形成而明显减轻NETs形成和炎症反应，同时保持中性粒细胞的吞噬和趋化活性［36-37］。川芎中的主要成分刺五加内酯Ⅰ（SEI）显著减少了NETs的形成，对CLP小鼠肺损伤有保护作用［38］。

还有一部分研究尝试从血小板-中性粒细胞相互作用的角度进行突破：氯吡格雷、普拉格雷、替卡格雷和康瑞尔等P2Y12抑制剂通过抑制血小板P-选择素的表达抑制血小板-白细胞相互作用［39］。外源性的重组血栓调节蛋白（RTM）可以抑制LPS模型中NETs形成，抑制除IL-1β外的所有细胞因子升高，提高脓毒症存活率［40］。

已有的研究肯定了通过NETs寻找脓毒症相关过度炎症反应的治疗的可行性和科学性，探索既能抑制过度炎症反应又不影响正常免疫细胞吞噬作用的新型治疗方案可能是未来脓毒症相关治疗研究的重点突破方向。

总之，脓毒症是一种促炎反应与抗炎反应同时亢进的高度异质性综合征。中性粒细胞作为先天免疫的第一道防线，外化核及胞质内容物是其发挥作用的重要途径。NETs本身的产生及释放可以为病情的进展提供优良的“示踪剂”，但过度的NETosis也可能成为免疫紊乱的罪魁祸首，寻找抑制NETs过度形成而不影响正常中性粒细胞吞噬、消化功能的药物，以及恰当的用药时间和剂量可能是脓毒症治疗的新方向。