温补肾阳单味中药及其有效成分防治骨质疏松症的可能分子机制研究进展

赵阳，宋京京，常晓盼，杨勇，孟东方

作者单位：1郑州市惠济区人民医院骨科，河南 郑州450000；2天津中医药大学第一附属医院国家中医针灸临床医学研究中心，天津300381；3郑州市骨科医院微创脊柱骨科，河南 郑州450000；4河南中医药大学第一附属医院骨伤科，河南 郑州450000

骨质疏松症（OP）病人骨量下降、骨微结构受到损坏，不仅会导致全身出现多关节骨性疼痛症状，还会使其发生脆性骨折的可能性大大提升。这与病人的年龄增长密切相关［1］，OP不仅影响着病人的身心状况，还增加了病人经济等方面的负担［2］。因此，怎样规范有效地防治OP及其并发症的发生就成为我国医疗人员必须解决的重大公共卫生问题。现代医学以西药治疗OP为主，起效快，可以减轻病人疼痛、提高骨密度。但长期应用西药后会使病人产生不良反应，导致病情反复，影响治疗效果。因此，研发应用疗效确切、安全经济的药物必然是今后防治OP的热点工作之一，而中医药在防治OP方面具有简、便、廉、验的特点。中医学理论认为，OP病人以肾虚为本［3］。数据挖掘发现，自古中医学家以“肾主骨生髓”为治疗OP的理论基石，在治疗OP相关的方药中，以杜仲、补骨脂、淫羊藿、骨碎补等为代表的温补肾阳类中药出现的频率最高［4］。且近年来研究表明，杜仲、骨碎补等具有温补肾阳功效的中药及其有效成分能够通过调控Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）、骨形态生成蛋白（BMP）/Smads等信号通路以达到调节骨代谢的作用。在此背景之下，对近年来温补肾阳类单味中药及其有效成分通过相关信号通路治疗OP的研究进展进行归纳总结显得尤为必要，因此本文在阐述骨代谢信号通路的基础上，通过综述杜仲、骨碎补等温补肾阳中药治疗OP的可能分子机制，以期为中医药临床治疗OP的进一步研究应用提供参考。

1 OP相关信号通路

现代研究表明，OP相关多种信号通路如Wnt/β-catenin、BMP/Smads、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、刺猬信号通路（Hedgehog）、Notch、磷脂酰肌醇-3磷酸激酶/AKT/雷帕霉素靶蛋白信号通路（PI3K/Akt/mTOR）等主要作用于成骨细胞，加强其增殖、分化；骨保护蛋白/NF-κB配体激活因子/NF-κB受体激活因子（OPG/RANKL/RANK）、雌激素、丝氨酸/苏氨酸激酶/过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Akt/PPAR-γ）、组织蛋白酶 K（CTSK）等主要作用于破骨细胞，抑制其增殖、分化，这些信号通路有其主要作用方向，但并不是孤立地、单一地发挥着作用。

1.1 促进骨形成的信号通路

1.1.1 Wnt/β-catenin信号通路 β-连环蛋白在成骨过程中发挥着进入细胞核激活成骨信号通路的关键作用，当Wnt信号通路被激活时，Wnt蛋白有关受体低密度脂蛋白相关受体5/6（LRP5/6）、卷曲蛋白（FZD）就会与相关配体蛋白结合，形成Wnt-FZD-LRP复合体。随后，在FZD的作用下蓬乱蛋白（Dvl）会与促进β-连环蛋白失活的相关蛋白复合体在细胞膜处进行结合，阻止β-连环蛋白失活过程，在其数量积累到一定程度就会进入细胞核激活Wnt相关靶基因［5］，促进BMSCs的成骨分化。

1.1.2 BMP/Smads信号通路 骨形态生成蛋白（BMPs）隶属于转化生长因子β（TGF-β）超家族，大量存在于骨基质当中，在诱导新骨形成过程中充当着启动因子的角色［6］。BMP/Smads信号通路蛋白传递到下游的关键赖于其特有的抗原与BMP膜受体（BMPR-ⅠA、ⅠB、Ⅱ）所形成的聚合体。经典的Smad蛋白依赖性BMP信号转导通路的激活是通过BMP配体与异源二聚体结合所介导的，膜受体BMPR与BMP结合激活BMPR-Ⅱ，进而启动受体Ⅰ的磷酸化进程，位于下游的小G蛋白信号传导蛋白1/5/8（Smad1/5/8）被活化的BMPR-Ⅰ激活，紧接着Smad4与活化的Smad1/5/8形成聚合物并移位至核内，启动脱氧核糖核酸结合蛋白的聚合过程，下游的BMP转录基因在上游转录因子的作用下进行表达，进而发挥其调控BMSCs分化的作用［7］。

1.1.3 MAPK信号通路 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路又称为非典型Smad信号通路，其调控骨细胞增殖的作用依赖于MAPK链上的3类蛋白激酶MAP3K-MAP2K-MAPK，蛋白激酶在细胞外基质、激素等因子的刺激下，启动MAPK链的磷酸化过程，下游分子在此过程接受上级信号并入核启动相关成骨基因的表达［8］。ERK通路与P38通路作为其子通路通过不同的促成骨机制发挥着调节骨代谢的作用，前者可明显增强成骨细胞（OB）活性并促进碱性磷酸酶（ALP）的表达，增强骨基质矿化；P38通路则主要通过提高BMP2蛋白的表达、进一步加强OB的矿化程度调控成骨细胞的分化［9］。

1.1.4 Hedgehog信号通路 Hedgehog基因高度保守，主要由Hedgehog信号蛋白、Ptched受体、Smo受体、Gli蛋白和下游靶基因组成。Hedgehog信号蛋白充当着Hedgehog信号通路启动蛋白的角色，其氨基端具有活性，在跨膜转运蛋白的协助下可与受体Patched-1（Ptch1）进行结合。当Hedgehog通路被激活时，Hedgehog信号蛋白与受体Ptched进行结合，解除Ptched受体对Smo的抑制作用，活化的Smo与苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶、类运动蛋白等进行结合，进一步激活锌指蛋白家族Gli蛋白使其入核启动Gli1、RunX2等下游靶基因的转录［10］。

1.1.5 PI3K/Akt/mTOR通路 G蛋白偶联受体（GPCRs）、受体酪氨酸激酶（RTK）在上游信号分子的作用下激活，紧接着活化下游的pi3-kinase激酶（PI3K），在PI3K的介导下细胞中磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）向磷脂酰肌醇-3，4，65-三磷酸（PIP3）完成结构转化。PIP2、PIP3是激活下游关键信号分子蛋白激酶B（Akt）不可或缺的蛋白体，二者均可直接结合Akt的普列克底物蛋白（pleckstrin）同源结构域以完成激活Akt的使命，活化的Akt通过磷酸化方式进一步直接激活其下游的效应因子化雷帕霉素靶蛋白复合体（mTOR），mTOR是由mTORC1、mTORC2两种不同的复合体组成的蛋白激酶，mTOR的激活通过促进mRNA的转运以诱导BMSCs分化为成骨细胞［11］。

1.1.6 Notch信号通路 同属跨膜蛋白的Notch家族受体（Notch1-4）、配体（DLL1、3、4，Jag1、Jag2）及DNA结合蛋白CSL蛋白、下游效应分子是Notch通路的主要组成部分。产生于内质网的Notch受体在其通往质膜的途径上被高尔基体中的furin样转化酶蛋白的作用下发生3次酶切反应后，具有活性的缺口胞内结构域（缺口ICD）释放并入核结合转录抑制因子CSL（CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合称，一种DNA结合蛋白）蛋白，并对其进行活化转化，并进一步作用于Notch通路的HES、HEY等下游靶基因并使之活化，进而调节细胞的增殖、分化［12］。张帅等［13］在成功构建去卵巢骨质疏松大鼠模型后，通过qRT-PCR检测得知模型大鼠Notch1表达下调，且与假手术组差异有统计学意义。

1.2 抑制骨吸收的信号通路

1.2.1 OPG/RANKL/RANK信号通路 OPG/RANKL/RANK信号通路主要由NF-κB受体激活剂（RANK）、NF-κB配体受体激活剂（RANKL）和骨保护素（OPG）组成。成骨细胞可以通过分泌OPG和RANKL来调节骨吸收，嵌入破骨细胞的RANKL与其在OCPs表面的受体（RANK）结合，作用于破骨细胞，使其分化、成熟。OPG可以与RANKL结合并抑制破骨细胞分化，这意味着OPG/RANKL的上调阻止了破骨细胞生成［14］。

1.2.2 CTSK信号通路 CTSK是一种蛋白水解酶，主要存在于破骨细胞中，主要参与降解OPN、骨连接蛋白等的降解，通过作用于骨胶原纤维，使其加速降解来促进骨吸收［15］。因此抑制CTSK对骨组织的降解作用，可能会对骨吸收起到抑制作用，对改善OP起到一定的作用。

1.2.3 Akt/PPAR-γ信号通路 PPAR-γ是Akt信号通路下游的关键影响因子，它是一种被细胞内脂质激活的转录因子，是脂肪细胞分化的重要转录因子，其与成骨分化呈负相关，可以上调骨髓间充质干细胞成脂作用，进而抑制调控骨髓间充质干细胞成骨作用来间接调控成骨细胞的分化和骨形成［16］。

1.2.4 雌激素信号通路 雌激素可通过抑制RANKL的活性，来抑制破骨细胞的分化。且有实验表明，雌激素下降与OPG/RANKL升高有关，雌激素在绝经早期通过OPG/RANKL途径抑制破骨细胞，从而改善骨丢失，这对原发性OP的相关研究有一定的启发作用［17］。

2 温补肾阳中药及其有效成分对OP的治疗及可能分子机制

基于上述的数据挖掘结果，故选择杜仲、补骨脂、淫羊藿和骨碎补作为温补肾阳类中药的代表。这些中药及其有效成分可通过不同的信号通路调节骨代谢，此类药物多为甘温之品，可奏甘温助阳、强筋壮骨之效，治疗筋骨痿软之症。基于中药功效学理论分析，中药治疗OP有望成为中药理论现代化的新契机，可以互补，以提升疾病治疗效果。

2.1 杜仲 Tian等［18］研究发现杜仲有效成分作用于去势骨质疏松模型小鼠后，可使其骨小梁数量和骨形成率增加，骨侵蚀面积减少，促血管生成因子神经轴突导向因子（SLIT3）水平增加。证明杜仲及其有效成分对OP可以起到一定的防治作用。

2.1.1 杜仲及其有效成分对促进骨形成相关通路的调控作用 Wang等［19］在研究杜仲有效成分环烯醚萜苷类治疗OP的分子机制时发现，环烯醚萜苷类具有多成分、多靶点、多途径的特点，主要通过PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等促进骨形成，起到抗骨质疏松的作用。有研究［20］表明，杜仲可上调Wnt/β-连环蛋白信号，可能通过激活Wnt信号通路促进成骨细胞增殖分化并提高其功能与活性，对缓解骨质疏松起到一定作用。再有段雨劼等［21］通过动物实验表明，杜仲可明确提高去势骨质疏松模型大鼠BMP-2表达，通过BMP/Smads信号通路实现骨保护作用。

2.1.2 杜仲及其有效成分对抑制骨吸收相关通路的调控作用 杜仲抑制骨吸收的主要信号通路是OPG/RANKL/RANK。Qi等［22］在建立醋酸铅诱导骨丢失大鼠模型的基础上，研究得知杜仲有效成分有效提高血清OPG及OPG/RANKL，从而抑制骨吸收。胡倩影等［23］的动物实验表明，杜仲有效成分可通过刺激OPG分泌和抑制RANKL表达来抑制骨吸收。也有研究表明杜仲有效成分可通过雌激素来抑制RANKL的活性，从而起到抑制破骨细胞的分化［19］。

基于以上研究，推测杜仲及其有效成分可能通过PI3K-Akt、MAPK、Wnt/β-catenin、OPG/RANKL/RANK、雌激素等信号通路或者信号通路之间的相互作用来平衡骨代谢，以起到对OP的防治作用。

2.2 骨碎补 王杰等［24］通过网络药理学及实验表明，骨碎补及其有效成分可改善绝经后OP模型大鼠的E2水平，提高骨密度。证明骨碎补及其有效成分对改善骨质疏松状态可以起到一定的作用。

2.2.1 骨碎补及其有效成分对促进骨形成相关信号通路的调控作用 Dong等［25］通过兔子动物实验发现骨碎补及其有效成分可以通过调节BMP，诱导骨细胞形成，改善骨质疏松水平。李晋玉等［26］在实验中运用Wnt通路抑制剂DKK1+，发现实验组转化生长因子β-catenin、LRP5、RUNX2、CyclinD1基因及蛋白表达明显增加，从而有可能促进成骨细胞增殖、分化。齐鹏飞等［27］发现在模拟失重状态下，应用骨碎补总黄酮可能激活MAPK/ERK信号通路，使MAPK/ERK磷酸化水平升高，进而促进间充质干细胞分化为成骨细胞。黄翔宇等［28］发现JaggedⅠ（Notch配体）联合去甲酸及骨碎补可抑制Notch信号通路，使Notch-1、Hes-1 mRNA和蛋白的表达下降，缓解骨质疏松症状。

2.2.2 骨碎补及其有效成分对抑制骨吸收相关信号通路的调控作用 张峻玮等［29］对OP模型大鼠使用骨碎补水煎液灌胃处理，之后提取骨髓间充质干细胞与破骨细胞共同培养，发现骨碎补可能通过调节OPG/RANKL/RANK信号通路来起到抑制破骨细胞增殖分化的作用，从而改善模型大鼠的骨质疏松症状。Wu等［30］实验证明骨碎补有效成分增强了雌激素抑制破骨细胞的作用，显著提高了骨质愈合率和骨强度。史晓林等［31］研究表明，骨碎补总黄酮可以抑制去卵巢OP模型大鼠CTSK对骨组织的降解作用，从而起到保护骨质的作用。

基于以上研究，推测骨碎补及其有效成分可能通过MAPK、Wnt/β-catenin、BMP/Smads、OPG/RANKL/RANK、Notch、CTSK等信号通路或者信号通路之间的相互作用来平衡骨代谢，以起到对OP的防治作用。

2.3 淫羊藿 张锦明等［32］通过对小鼠连续皮下注射地塞米松诱导骨质疏松后，予实验组小鼠灌胃淫羊藿苷，发现小鼠胫骨和股骨总湿质量、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目均得到明显改善。由上可知，淫羊藿及其有效成分有可能通过促进成骨细胞的骨形成和抑制破骨细胞的骨吸收作用，达到防治OP的目的。

2.3.1 淫羊藿及其有效成分对促进骨形成相关信号通路的调控作用 徐众华等［33］研究表明淫羊藿总黄酮可通过调控BMP/Runx2/Osx信号通路以上调信号蛋白的表达，显著改善骨质水平。Hu等［34］通过实验表明，淫羊藿苷可通过调节PI3K/Akt/GSK3β/β-连环蛋白整合信号通路促进骨形成，增加模型小鼠的小梁骨体积和皮质骨厚度，对于糖皮质激素等诱导的继发性OP具有一定的作用。Wang等［35］发现淫羊藿苷能够上调Runx2、cyclin D1和ALP的mRNA等Wnt上下游基因的表达水平，促进成骨细胞增殖。Liu等［36］研究发现淫羊藿苷可通过抑制p-ERKS、p-P38、p-JNK抵抗细胞自噬，说明淫羊藿苷可通过MAPK信号通路来保护BMSCs。辛红美等［37］通过实验研究发现，应用淫羊藿苷的实验组小鼠成骨细胞增殖明显，表明淫羊藿苷能够通过Hedgehog信号通路促进成骨细胞增殖和分化。

2.3.2 淫羊藿及其有效成分对抑制骨吸收相关信号通路的调控作用 Qi等［38］研究表明淫羊藿苷能增加OPG/RANKL的比例、抑制骨代谢和骨髓脂肪生成、上调骨RUNX 2和OPG表达的能力，从而起到治疗OP的作用。Wang等［39］通过淫羊藿苷和强制性动态负荷刺激联合应用于去卵巢小鼠，发现淫羊藿苷能通过OPG/RANKL/RANK信号通路对OP起到治疗作用，但两者联合效果更好。还有研究［40］证明，口服淫羊藿苷可以抑制PPAR-γ表达，促进骨吸收并抑制骨髓腔中脂肪细胞的形成。

基于以上研究，推测淫羊藿及其有效成分可能通过Wnt/β-catenin、MAPK、BMP/Smads、Hedgehog、PI3K/Akt/mTOR、Notch、OPG/RANKL/RANK、PPAR-γ等信号通路或者信号通路之间的相互作用来平衡骨代谢，以起到对OP的防治作用。

2.4 补骨脂 许妍等［41］研究发现，补骨脂能显著提高OP模型大鼠的BMD、骨生物力学强度，明显改善骨小梁结构的完整性，且盐炙补骨脂效果更佳。由此可知，补骨脂可以防治OP。

2.4.1 补骨脂及其有效成分对促进骨形成相关信号通路的调控作用 Huang等［42］研究表明，补骨脂素能通过激活TGF-β/Smad3通路增加hBMSCs的增殖和活性，且低浓度时效果更强。Yu等［43］研究发现，培养的成骨细胞β-连环蛋白的核转位被应用的补骨脂素触发，并被Wnt/β-连环蛋白信号传导抑制剂DKK-1阻断，表明补骨脂素的成骨功能可通过Wnt/β-catenin信号的激活而发挥。

2.4.2 补骨脂及其有效成分对抑制骨吸收相关信号通路的调控作用 补骨脂抑制骨吸收的主要信号通路是OPG/RANKL/RANK。周倚墨等［44］通过地塞米松诱导成功OP大鼠模型，应用补骨脂提取物作用于模型大鼠后，发现可能通过上调骨保护蛋白表达、下调RANKL表达使得大鼠骨密度得到明显提高。

基于以上研究，推测补骨脂及其有效成分可能通过Wnt/β-catenin、BMP/Smads、OPG/RANKL/RANK等信号通路或者信号通路之间的相互作用来平衡骨代谢，以起到对OP的防治作用。

上述研究表明，中药活性成分的精准提取是进行机制研究的前提，上述温补肾阳单味中药抗OP疗效确切，因此今后更应注重优化其活性成分的工艺提取，为进一步机制研究提供更优化的工艺提取方案；现阶段，关于温补肾阳单味中药及其有效成分对骨代谢的可能分子机制研究已经取得很大成果，对防治OP具有多靶点、多途径的优势，其中淫羊藿及其有效成分与骨代谢相关通路关联较多、应用较广、研究较多、意义最大，但是也不可忽略其他中药与OP可能相关的研究。

3 总结与展望

中医中将OP归属“骨痿、骨枯”等范畴。关于OP相关症状及发病机制的描述，《黄帝内经》及诸多古代著作中有很多经典论述，《素问·六节脏象论》云：“肾者主蛰，……其充在骨，肾为先天之本，……主骨生髓”。《医经精义》曰：“肾藏精，精生髓，髓养骨，……髓足则骨强。”由此说明，肾精肾气与骨生长发育、维持骨量有关，很显然“肾主骨”指导思想早年就已经确立，从脏腑、精气学说出发肯定了“肾精不足、髓减骨痿”的OP发病机理［45］。

中医中，“肾主骨”从功能出发。与之相比，现代医学从微观机制进行分析。中医“肾”与现代医学中内分泌等关系密切，肾与骨在胚胎发育学方面具有同源性，此外肾脏中钙磷可通过与特异性受体结合或通过RANKL等信号通路参与骨代谢过程；另外，肾脏经自身调节调控钙磷稳态，并进一步影响到人体的骨骼矿化、结构，参与骨代谢所需活性物质生成。故“从肾论治”出发防治OP具有充足的理论基础及切实的实际意义［46］。杜仲、骨碎补、淫羊藿等温热之品可入肾经，发挥温补肾阳，强筋健骨之效，肾阳为一身阳气之本，“五脏之阳气、非此不能发”，肾之阳气充足则能推动肾精的化生，肾精充足则髓生化有源，骨得髓养，则骨骼强健。而这些中药有效成分又可通过Wnt/β-catenin、BMP/Smads、PI3K/Akt/mTOR等信号通路稳定骨代谢的平衡，发挥抗OP的药效作用。

综上所述，随着中医药在防治OP方面发挥着越来越重要的作用，我们在传承中医治疗“骨痿”等疾病优势的同时，应更注重其现代药理机制的探索。同时，在运用补肾阳药物治疗OP的同时，临床遣方用药应求阴阳平衡，以防温补太过，发为温燥之疾。随着骨代谢信号通路机制研究的进展，温补肾阳中药成分在微观层面抗OP治疗方面是一个新的研究方向，为药物的研制以及未来的治疗工作提供参考，以期可提高病人治疗以及预后效果；且骨代谢相关信号通路并不是独立工作的，各通路之间相互作用，仅进行单一的研究，具有颇多局限性。因此骨代谢信号通路间的相互联系、相互作用应是未来研究的热点与重点之一。