萝卜硫素调节腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节器1/过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α信号通路对妊娠高血压大鼠妊娠结局的影响

马合红，侯秀真，冯妙肖，张俊峰

作者单位：沧州市中心医院产科，河北 沧州061001

妊娠期高血压疾病（HDP）严重威胁母亲和婴儿的健康［1］。HDP的主要生理变化是全身性血管痉挛和各器官灌注减少，主要临床症状为高血压、水肿和蛋白尿［2］。但HDP的病因尚未完全阐明。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也是调节生物能量代谢的关键分子，其调节沉默信息调节器1（SIRT1）的活性，活化的AMPK和SIRT1进一步调节过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α（PGC-1α）的活性，AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路充当能量传感网络，在线粒体生物合成、能量代谢和氧化应激中起着至关重要的调节作用［3-4］。已有研究证明AMPK在胚胎和胎盘发育中起着至关重要的作用，其失调可能导致妊娠相关疾病，如宫内生长受限、胎盘功能不全或先兆子痫［5-6］。萝卜硫素（SFN）是硫代葡萄糖苷的主要水解活性产物，属于异硫氰酸酯家族，广泛存在于西兰花、羽衣甘蓝、胡萝卜等十字花科蔬菜中，其具有抗氧化、抗炎、抗癌和免疫调节功能［7］。已有报道，SFN可改善妊娠高血压妇女的内皮功能和血压，但并未对其作用机制进行研究阐述［8］。另外也有研究表明SFN可以通过抑制c-Jun氨基末端激酶/p38丝裂原活化蛋白激酶（JNK/p38 MAPK）通路的激活减轻左旋硝基精氨酸甲基酯（L-NAME）诱导的胎盘滋养层细胞的炎症反应并可以抑制细胞凋亡［9］。基于AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路在胚胎发育过程中的重要影响以及SFN对胚胎的积极影响，本研究推测SFN可通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路影响妊娠结局。因此，本研究从2021年3月至2022年12月，通过建立L-NAME诱导的HDP大鼠模型，探讨SFN是否可通过AMPK/SIRT1/PGC-1a信号通路影响HDP大鼠妊娠结局。

1 材料与方法

1.1 实验动物 70只SD雌性大鼠和35只SD雄性大鼠购自中国科学院动物研究所［生产许可证号SCXK（京）2021-0012］。所有大鼠饲养在（23±2）℃（55±5）%恒温恒湿动物房中，人工12 h光暗循环，自由饮水饮食。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2 实验试剂 L-NAME（批号orb134513）购自武汉博欧特生物科技有限公司；萝卜硫素（批号BJ-0406）购自北京凯诗源生物科技有限公司；硫酸镁注射液（10 mL∶2.5 g，H41025692，批号20220421）购自裕松源药业有限公司；AMPK抑制剂Compound C（批号HY-13418A）购自MCE公司；尿蛋白定量测试盒（批号C035-2-1）、血肌酐（SCr）测定试剂盒（批号C011-2-1）、血尿素氮（BUN）测试盒（批号C013-2-1）购自南京建成生物工程研究所；胎盘生长因子（PLGF）抗体（批号ab9542）、可溶性血管内皮生长因子受体-1（sFLT-1）抗体（批号ab176561）和辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（批号ab6721）购自英国abcam公司；内皮型一氧化氮合酶（eNOs）抗体（批号PA5-16887）、p-eNOs抗体（批号36-9100）、p-AMPK抗体（批号PA5-17831）、AMPK抗体（批号PA5-17398）、SIRT1抗体（批号MA5-15677）、PGC-1a抗体（批号PA5-72948）和β肌动蛋白（β-actin）抗体（批号MA1-140）购自美国赛默飞公司。

1.3 实验动物造模及分组 将大鼠雌雄比例为2∶1合笼饲养，观察雌鼠阴栓判断雌鼠受孕情况，共有70只雌鼠受孕成功，当可以观察到雌鼠阴栓时记为妊娠第1天。所有妊娠大鼠分为对照组、HDP组、SFN-L组［10］（SFN 5 mg/kg）、SFN-M组（SFN 15 mg/kg）、SFN-H组（SFN 30 mg/kg）、硫酸镁组［11］（硫酸镁注射液100 mg/kg）、Compound C组［3］（SFN 30 mg/kg+AMPK抑制剂Compound C 0.25 mg/kg），每组10只。

除对照组大鼠外其余大鼠妊娠第13天起尾静脉注射7 mg/kg L-NAME，连续注射4 d，对照组大鼠尾静脉注射0.9%氯化钠溶液，于妊娠第13天和第16天检测大鼠尾动脉压验证造模是否成功，当收缩压高于110 mmHg时，显示造模成功［12］。造模成功后，将70只雌性孕鼠分为各从造模成功第1天（妊娠第17天）起，SFN-L、M、H组、硫酸镁组每日通过肌内注射相应剂量的SFN和硫酸镁镁注射液，对照组、HDP组每日肌内注射相应剂量的0.9%氯化钠溶液，抑制剂组在肌肉注射SFN的同时尾静脉注射相应剂量的Compound C，其余组注射相应剂量的0.9%氯化钠溶液，连续给药至妊娠第20天。给药结束后（妊娠第21天）使用3%戊巴比妥钠麻醉各组大鼠，腹主动脉取血，并进行剖宫术取出胎鼠和胎盘组织，取出大鼠肾脏组织，观察胎鼠，胎盘组织快速称重后在液氮中保存。

1.4 血压测量仪检测HDP大鼠尾动脉压 分别在妊娠第17天和第20天，使用血压仪检测各组大鼠尾动脉压。

1.5 试剂盒法检测各组大鼠24 h尿蛋白含量和血清SCr、BUN水平 将各组妊娠大鼠放入代谢笼中收集第17天和第20天24 h尿液，检测24 h尿蛋白含量。腹主动脉收集的血液在4 ℃下3 000 r/min转速，离心半径15 cm离心10 min获得血清，根据试剂盒说明书检测血清SCr和BUN水平。

1.6 观察检测妊娠结局指标 妊娠第21天，各组大鼠剖腹取胎，记录胎鼠质量，记录胎死率和产仔数。

1.7 HE染色观察胎盘组织和肾脏组织变化 取各组5只大鼠胎盘和肾脏组织，经固定、脱水、包埋、切片后，使用HE染色，显微镜下观察胎盘和肾脏组织病理情况。

1.8 蛋白质印迹法检测相关蛋白水平 另外各组5只大鼠胎盘组织使用放射免疫沉淀法裂解缓冲液（RIPA）裂解后提取蛋白质并用二喹啉甲酸（BCA）方法测定蛋白质浓度。蛋白质经变性后使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白并转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，然后使用5%脱脂奶粉封闭，再加入一抗sFLT-1、PLGF、peNOs、eNOs、p-AMPK、AMPK、SIRT1、PGC-1a和β-actin，4 ℃孵育过夜，然后加入二抗在室温下孵育2 h，洗膜后加入显色液观察，使用Image J软件量化各组蛋白灰度值。

1.9 统计学方法 所有数据均使用SPSS 25.0软件进行统计分析，并表示为。数据间比较采用单因素方差分析，进一步两组间比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血压和24 h尿蛋白情况 妊娠第17天，与对照组比较，HDP组、SFN-L组、SFN-M组、SFN-H组、硫酸镁组、Compound C组大鼠血压和24 h尿蛋白定量水平升高（P＜0.05），但各组间差异无统计学意义（P＞0.05），表明HDP大鼠模型建立成功；妊娠第20天，与对照组相比，HDP组大鼠血压和24 h尿蛋白定量水平升高（P＜0.05）；与HDP组相比，SFN-L组、SFN-M组、SFN-H组和硫酸镁组大鼠血压和24 h尿蛋白定量水平降低（P＜0.05）；与SFN-H组相比，Compound C组大鼠血压和24 h尿蛋白定量水平升高（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠血压和24 h尿蛋白定量比较/

表1 各组大鼠血压和24 h尿蛋白定量比较/

注：HDP为妊娠期高血压疾病，SFN-L为萝卜硫素低剂量，SFN-M为萝卜硫素中剂量，SFN-H为萝卜硫素高剂量。①与对照组相比，P＜0.05。②与HDP组相比，P＜0.05。③与SFN-L组相比，P＜0.05。④与SFN-M组相比，P＜0.05。⑤与SFN-H组相比，P＜0.05。

组别对照组HDP组SFN-L组SFN-M组SFN-H组硫酸镁组Compound C组F值P值血压/mmHg 24 h尿蛋白定量/（mg/L）妊娠第20天123.17±20.19 679.38±64.32①595.91±53.05②532.23±49.76②③461.16±35.15②③④482.74±39.58②558.85±41.23⑤153.84＜0.001鼠数10 10 10 10 10 10 10妊娠第17天102.42±4.22 149.77±5.16①151.85±5.07①148.62±4.96①154.46±4.59①150.17±5.01①153.28±5.38①142.72＜0.001妊娠第20天101.63±4.15 152.52±4.79①136.91±5.16②129.25±4.54②③117.33±4.19②③④121.72±4.61②137.96±4.73⑤127.97＜0.001妊娠第17天122.72±20.06 676.66±63.94①669.43±61.09①673.51±65.57①662.92±69.61①679.43±74.16①682.25±60.25①114.82＜0.001

2.2 各组大鼠胎鼠质量、产仔数、胎鼠病死率及胎盘质量 与对照组相比，HDP组大鼠胎鼠质量、产仔数及胎盘质量降低，胎鼠病死率升高（P＜0.05）；与HDP组相比，SFN-L组、SFN-M组、SFN-H组和硫酸镁组大鼠胎鼠质量、产仔数及胎盘质量升高，胎鼠病死率降低（P＜0.05）；与SFN-H组相比，Compound C组大鼠胎鼠质量、产仔数及胎盘质量降低，胎鼠病死率升高（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠胎鼠质量、产仔数、胎鼠病死率及胎盘质量比较/

表2 各组大鼠胎鼠质量、产仔数、胎鼠病死率及胎盘质量比较/

注：HDP为妊娠期高血压疾病，SFN-L为萝卜硫素低剂量，SFN-M为萝卜硫素中剂量，SFN-H为萝卜硫素高剂量。①与对照组相比，P＜0.05。②与HDP组相比，P＜0.05。③与SFN-L组相比，P＜0.05。④与SFN-M组相比，P＜0.05。⑤与SFN-H组相比，P＜0.05。

组别对照组HDP组SFN-L组SFN-M组SFN-H组硫酸镁组Compound C组F值P值胎盘质量/g 0.58±0.12 0.32±0.06①0.38±0.05②0.43±0.09②③0.51±0.10②③④0.49±0.08②0.41±0.06⑤10.99＜0.001鼠数10 10 10 10 10 10 10胎鼠质量/g 4.75±0.43 2.32±0.19①2.86±0.26②3.27±0.29②③3.95±0.21②③④3.84±0.32②3.18±0.25⑤※76.66＜0.001产仔数/个11.70±0.69 7.10±0.57①8.40±0.62②9.20±0.51②③10.10±0.65②③④9.80±0.59②8.60±0.63⑤57.12＜0.001胎鼠病死率/%0.96±0.11 28.57±2.08①20.06±1.74②13.12±1.69②③5.71±0.53②③④5.99±0.61②15.53±1.17⑤520.03＜0.001

2.3 各组大鼠胎盘病理情况 如图1，对照组大鼠胎盘结构正常；较对照组大鼠，HDP组大鼠胎盘组织胎盘绒毛数量减少，胎盘结构缩小，部分绒毛显示纤维蛋白样坏死；SFN-L组、SFN-M组、SFN-H组和硫酸镁组较HDP组，胎盘结构异常程度减轻，胎盘病变得到缓解，然而Compound C组加剧了胎盘病变程度。

图1 各组大鼠胎盘组织病理情况（HE染色×400）

2.4 各组大鼠肾脏病变情况 对照组大鼠肾脏组织形态良好，肾小球结构正常；较对照组，HDP组大鼠肾小球数目减少，结构异常，血清SCr和BUN水平升高（P＜0.05）；与HDP组比较，SFN-L组、SFN-M组、SFN-H组和硫酸镁组肾小球结构异常程度减轻，病变情况有所改善，血清SCr和BUN水平降低（P＜0.05）；与SFN-H组相比，Compound C组大鼠肾小球病变程度加重，血清SCr和BUN水平升高（P＜0.05），见表3，图2。

图2 各组大鼠肾脏组织病理情况（HE染色×400）

表3 各组大鼠血清SCr和BUN水平比较/

表3 各组大鼠血清SCr和BUN水平比较/

注：SCr为血肌酐，BUN为血尿素氮，HDP为妊娠期高血压疾病，SFN-L为萝卜硫素低剂量，SFN-M为萝卜硫素中剂量，SFN-H为萝卜硫素高剂量。①与对照组相比，P＜0.05。②与HDP组相比，P＜0.05。③与SFN-L组相比，P＜0.05。④与SFN-M组相比，P＜0.05。⑤与SFN-H组相比，P＜0.05。

BUN/（mmol/L）3.96±0.27 8.17±0.72①6.93±0.67②6.28±0.64②③5.53±0.49②③④5.79±0.55②6.46±0.61⑤49.89＜0.001组别对照组HDP组SFN-L组SFN-M组SFN-H组硫酸镁组Compound C组F值P值鼠数10 10 10 10 10 10 10 SCr/（µmol/L）37.49±2.97 75.93±5.94①67.56±5.52②59.18±5.09②③48.67±5.33②③④49.72±4.86②62.64±5.71⑤63.58＜0.001

2.5 各组大鼠胎盘组织蛋白表达情况 较对照组，HDP组大鼠胎盘组织PLGF、p-eNOs、p-AMPK、SIRT1和PGC-1a蛋白表达降低，sFLT-1表达升高（P＜0.05）；与HDP组比较，SFN-L组、SFN-M组、SFN-H组和硫酸镁组大鼠胎盘组织PLGF、p-eNOs、p-AMPK、SIRT1和PGC-1a蛋白表达升高，sFLT-1表达降低（P＜0.05）；与SFN-H组相比，Compound C组大鼠胎盘组织PLGF、p-eNOs、p-AMPK、SIRT1和PGC-1a蛋白表达降低，sFLT-1表达升高（P＜0.05），见图3，表4。

图3 各组大鼠胎盘组织sFLT-1、PLGF、p-eNOs和AMPK/SIRT1/PGC-1a通路蛋白表达情况

表4 各组大鼠胎盘组织sFLT-1、PLGF、p-eNOs和AMPK/SIRT1/PGC-1a通路蛋白表达情况/

表4 各组大鼠胎盘组织sFLT-1、PLGF、p-eNOs和AMPK/SIRT1/PGC-1a通路蛋白表达情况/

注：sFLT-1为可溶性血管内皮生长因子受体-1，PLGF为胎盘生长因子，eNOs为内皮型一氧化氮合酶，p-eNOs为磷酸化eNOs，SIRT1为沉默信息调节器1，PGC-1α为过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α，AMPK为腺苷酸活化蛋白激酶，p-AMPK为磷酸化AMPK，β-actin为β肌动蛋白，HDP为妊娠期高血压疾病，SFN-L为萝卜硫素低剂量，SFN-M为萝卜硫素中剂量，SFN-H为萝卜硫素高剂量。①与对照组相比，P＜0.05。②与HDP组相比，P＜0.05。③与SFN-L组相比，P＜0.05。④与SFN-M组相比，P＜0.05。⑤与SFN-H组相比，P＜0.05。

p-AMPK/AMPK 0.94±0.13 0.36±0.07①0.49±0.09②0.63±0.10②③0.75±0.12②③④0.73±0.11②0.57±0.08⑤17.32＜0.001组别对照组HDP组SFN-L组SFN-M组SFN-H组硫酸镁组Compound C组F值P值鼠数10 10 10 10 10 10 10 sFLT-1/β-actin 0.53±0.09 0.98±0.10①0.91±0.15②0.79±0.12②③0.66±0.11②③④0.68±0.14②0.75±0.12⑤8.14＜0.001 PLGF/β-actin 1.34±0.16 0.73±0.14①0.81±0.11②0.94±0.13②③1.16±0.15②③④1.13±0.12②0.89±0.09⑤13.84＜0.001 p-eNOs/eNOs 0.96±0.14 0.32±0.05①0.41±0.08②0.55±0.09②③0.69±0.11②③④0.67±0.05②0.53±0.07⑤27.43＜0.001 SIRT1/β-actin 0.89±0.12 0.31±0.04①0.42±0.07②0.55±0.09②③0.67±0.10②③④0.64±0.11②0.48±0.08⑤21.89＜0.001 PGC-1a/β-actin 1.02±0.14 0.59±0.12①0.68±0.14②0.77±0.11②③0.89±0.13②③④0.85±0.14②0.74±0.15⑤5.68＜0.001

3 讨论

HDP是妊娠母亲在妊娠约20周后突然出现高血压，这种疾病在正常妊娠过程中出现，是孕妇和围产期儿童死亡的主要原因，在所有妊娠中发生率约为6%～8%，主要并发症包括子痫、胎盘早剥（AP）、宫内发育迟缓（IUGR）、低出生体质量（LBW）婴儿甚至会发生新生儿死亡［13-14］。在本研究中，HDP大鼠血压升高，24 h尿蛋白定量水平增加，胎盘和胎鼠质量以及产仔数降低，并导致了严重的胎盘和肾脏组织学的改变，表明HDP大鼠造模成功。

SFN是一种天然存在于十字花科蔬菜中的有机硫，已证明SFN具有保护内皮细胞，改善缺血再灌注损伤后的视网膜、肾脏和肝脏功能，另外，SFN也可改善心血管疾病（如慢性高血压和动脉粥样硬化等）［15］。Padron等［16］也发现SFN可通过激活核因子E2相关因子2（Nrf2）来调节胎膜中的抗氧化反应，从而改善妊娠结局。本研究发现SFN可以降低HDP大鼠血压，降低HDP大鼠胎鼠病死率和胎盘病变程度，增加HDP大鼠胎盘质量、产仔数、胎鼠质量，表明SFN对HDP大鼠妊娠结局也具有改善作用，并且发现SFN对HDP大鼠妊娠结局的改善作用随着给药剂量的增加，效果更加明显，SFN高剂量组作用效果与临床常用药硫酸镁效果相当。本研究还发现SFN可增加HDP大鼠胎盘组织PLGF、p-eNOs的蛋白表达，降低sFLT-1的表达。sFLT-1可以通过抑制滋养层细胞的合成来影响滋养层细胞的浸润，从而导致胎盘绒毛的浅层植入和先兆子痫的发展，已有研究表明sFLT-1水平随着HDP严重程度的增加而显著增加［17］。sFLT-1的表达会促进胎盘血管内皮细胞的损伤，导致局部炎症反应的发生，从而促进平滑肌痉挛并导致胎盘灌注阻力系数增加。PLGF对滋养层细胞的血管生成，增殖，迁移和侵袭表现出促进作用，在胎盘组织中高度表达［18］。另外，通过研究怀孕小鼠发现，一氧化氮（NO）在调节免疫力和血压方面起着重要作用，一氧化氮合酶（NOS）的急性阻断抑制NO合成导致血压升高，抑制eNOS表达可导致高血压，蛋白尿，血小板减少症，肾损伤和胎儿生长受限［19］。由此表明SFN是通过调节HDP大鼠胎盘组织PLGF、peNOs和sFLT-1的表达来改善HDP大鼠妊娠结局。

HDP的发生伴有肾损伤和蛋白尿，HDP病人肾动脉血管痉挛而致血流量减少，肾脏灌注压下降，肾小球梗死，基底膜受损，通透性增加，导致大量蛋白尿的生成［20］。本研究结果发现SFN缓解HDP大鼠肾小球结构病变情况，降低血清SCr和BUN水平，并呈剂量依赖性，其高剂量作用效果与硫酸镁作用效果相当。Scr和BUN的升高可能是肾小球损伤的信号，会增加氧化应激和自由基导致肾小球坏死并影响肾脏过滤能力［21］。Li等［22］也研究发现预防性给予他达拉非可改善L-NAME诱发的高血压、蛋白尿、孕期母体体质量减轻、胎儿生长受限，并减轻胎盘和肾组织的炎症反应。Hamza等［23］也研究发现G蛋白耦联受体APJ的内源性配体（apelin-13）可降低L-NAME 诱发的先兆子痫大鼠血清SCr和BUN水平，并可改善先兆子痫大鼠肾脏组织结构。而本研究结果与其有相似之处，表明SFN可缓解HDP大鼠肾损伤，改善妊娠结局。

作为一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，AMPK对生物能量的代谢具有触发作用，当AMPK被激活时，它可以监测线粒体的功能和细胞的能量状态，并激活SIRT1的活性，进一步激活PGC-1α［24］，已有研究报道AMPK参与妊娠期血压的控制和肾脏生理学［25］。另有研究发现SFN可通过上调了p-AMPK，SIRT1和PGC-1a的表达激活AMPK/SIRT1/PGC-1a信号通路，缓解LPS诱导的肠上皮损伤，其抑制剂拮抗了SFN对肠上皮细胞的保护作用［27］。值得注意的是本研究结果发现SFN呈剂量依赖性增加p-AMPK、SIRT1和PGC-1a的蛋白表达激活AMPK/SIRT1/PGC-1a通路改善HDP大鼠妊娠结局，AMPK抑制剂Compound C的加入减弱了SFN对HDP大鼠妊娠结局的改善作用，有研究显示白藜芦醇会改善高脂饮食和L-NAME联合诱发的孕鼠后代的程序性高血压，其通过激活AMPK/PGC-1α通路降低氧化应激调节后代血压以防止发育性高血压［26］。本结果与其基本一致，提示SFN可能是通过激活AMPK/SIRT1/PGC-1a通路改善HDP大鼠妊娠结局。

综上所述，SFN可以改善HDP大鼠蛋白尿、高血压、肾损伤和妊娠结局，其通过激活AMPK/SIRT1/PGC-1a发挥作用。这一结果可为SFN治疗HDP提供实验依据。