非酒精性脂肪性肝病病人血清长链非编码RNA人类白细胞抗原复合体18水平与氧化应激指标、肝纤维化程度的相关性

符鑫，刘悦，彭鑫，黄婷婷，廖雪霞，张曼

作者单位：1儋州市人民医院消化内科，海南 儋州571799；2华中科技大学同济医学院附属协和医院消化肿瘤外科，湖北 武汉430023

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在没有已知因素（如饮酒或使用致脂肪药物）诱导干细胞中脂质积累的情况下出现的肝细胞中脂肪积累量超过5%［1］，与胰岛素抵抗及遗传易感因素密切相关，随着时间的推移可演变成肝硬化甚至肝癌［2］。研究证实，肝纤维化和氧化应激在NAFLD疾病进展过程中发挥着重要作用［1，3］。已知长链非编码RNA人类白细胞抗原复合体18（lncRNA HCG18）在肝癌组织中呈现高表达，能够促进癌细胞的增殖及迁移［4］，Xia等［5］学者研究发现lncRNA HCG18在NAFLD病人血清中表达升高，并与胰岛素抵抗相关，对NAFLD具有较高的诊断价值。但关于lncRNA HCG18与NAFLD病人氧化应激及肝纤维化程度的研究尚未见报道。本研究通过对92例NAFLD病人与90例健康体检志愿者进行对比研究，探讨血清lncRNA HCG18与氧化应激指标及肝纤维化程度的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以儋州市人民医院2020年11月至2022年3月收治的92例NAFLD病人为NAFLD组，另选取同期健康体检志愿者90例为对照组。NAFLD组中男性44例，女性48例，年龄范围40～78岁，年龄（58.25±8.48）岁，身体质量指数（BMI）为（25.70±2.35）kg/m2；对照组中男性41例，女性49例；年龄范围42～77岁，年龄（59.20±8.84）岁，BMI为（25.46±2.23）kg/m2。

纳入标准：（1）NAFLD组病人符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018更新版）》中NAFLD相关诊断标准［6］；（2）对照组体检结果显示肝功能正常；（3）认知功能正常，依从性好。排除标准：（1）合并糖尿病病人；（2）合并其他肝病病人；（3）合并恶性肿瘤病人；（4）有过量饮酒史病人；（5）自身免疫病病人。两组受试者对研究内容知情并签署书面同意书。本研究经儋州市人民医院医学伦理委员会批准（批号20220518）。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料收集 病人入院后，收集一般资料，包括性别、年龄、BMI；检测病人生化指标，包括血小板计数（PLT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、谷氨酰转肽酶（GGT）、白蛋白（ALB）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS），计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.2.2 血液样本收集 NAFLD组病人于入院次日清晨采集空腹静脉血10 mL，对照组于体检当日空腹状态下采集静脉血10 mL，离心分离血清，-80 ℃冰箱中保存待测。

1.2.3 血清lncRNA HCG18水平测定 严格按照Trizol试剂盒（赛默飞世尔科技公司，货号15596026）说明书操作，分别提取NAFLD组及对照组血清中总RNA，使用反转录试剂盒（日本Takara公司，货号RRO47AA）反转录成cDNA，以cDNA为模板，采用qRT-PCR仪（美国Bio-Rad公司，型号CFX384）检测血清lncRNA HCG18相对表达水平（PCR反应体系20 µL：cDNA模板1 µL、双蒸水7µL、正向引物1 µL、反向引物1 µL、2×Taq PCR master mix 10 µL），条件为95 ℃初始变性45 s；然后在95 ℃变性15 s，55 ℃退火1 min，35个循环。使用2-ΔΔCt方法分析血清lncRNA HCG18表达水平。以GAPDH为内参基因，引物由北京百瑞极生物科技有限公司提供，引物序列如下：lncRNA HCG18正向5'-ATCCTGCCAATAGATGCTGCTCAC-3'，反向5'-AGCCACCTTGGTCTCCAGTCTC-3'；GAPDH正向5'-TGACGTGCCGCCTGGAGAAAC-3'，反向5'-CCGGCATCGAAGGTGGAAGAG-3'。

1.2.4 血清氧化应激指标测定 采用酶联免疫（ELISA）法检测血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）水平，试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

1.2.5 NAFLD肝纤维化（NFS）评分［7］NFS=-1.675+0.037×年龄（岁）+0.094×BMI+1.13×FPG受损/糖尿病（是=1，否=0）+0.99×AST/ALT（率）-0.013×PLT（×109/L）-0.66×ALB（g/dL）。NFS＜-1.455为排除晚期纤维化组（30例），-1.455～0.676为中间状态组（46例），NFS＞0.676为晚期纤维化组（16例）。

1.3 统计学方法 本研究中所有数据采用SPSS 25.0进行分析。计量资料符合正态分布，采用表示，两组间比较采用独立样本t检验；三组间差异比较采用单因素方差分析检验，进一步两两比较采用SNK-q检验；性别等计数资料以例（%）表示，并进行χ2检验比较；Pearson相关性分析血清lncRNA HCG18与GSH-Px、丙二醛、SOD的关系；Spearman相关性分析血清lncRNA HCG18与NFS评分的关系；受试者操作特征（ROC）曲线评价血清lncRNA HCG18表达水平对NAFLD的诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料对比 两组性别、年龄、BMI、ALB、TC比较差异无统计学意义（P＞0.05），PLT、AST、ALT、GGT、TG、HDL-C、LDL-C、FPG、FINS、HOMA-IR比较差异有统计学意义（P＜0.001）。见表1。

表1 健康体检志愿者90例与NAFLD 92例一般资料比较

2.2 两组血清lncRNA HCG18与氧化应激指标水平比较 NAFLD组lncRNA HCG18、丙二醛水平明显高于对照组（P＜0.001），GSH-Px、SOD水平明显低于对照组（P＜0.001）。见表2。

表2 健康体检志愿者90例与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）92例血清lncRNA HCG18与氧化应激指标水平比较/

表2 健康体检志愿者90例与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）92例血清lncRNA HCG18与氧化应激指标水平比较/

注：lncRNA HCG18为长链非编码RNA人类白细胞抗原复合体18，GSH-Px为谷胱甘肽过氧化物酶，SOD为超氧化物歧化酶。

SOD/（U/mL）92.84±12.89 68.36±10.65 13.98＜0.001组别对照组NAFLD组t值P值例数90 92 lncRNA HCG18 1.01±0.24 1.37±0.29 9.11＜0.001 GSH-Px/（U/mL）98.25±13.92 72.39±11.26 13.79＜0.001丙二醛/（µmol/L）4.17±1.04 6.96±2.13 11.19＜0.001

2.3 不同肝纤维化程度组一般资料对比 三组年龄、BMI、PLT、AST、ALT、GGT、FINS、HOMA-IR比较差异显著（P＜0.05）。排除晚期纤维化组、中间状态组、晚期纤维化组年龄、BMI、AST、ALT、GGT、HOMA-IR依次显著升高（P＜0.001），FINS依次显著升高（P＜0.05），PLT依次显著降低（P＜0.05）。见表3。

表3 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）92例不同肝纤维化程度组一般资料对比

2.4 不同肝纤维化程度组血清lncRNA HCG18与氧化应激指标水平比较 排除晚期纤维化组、中间状态组、晚期纤维化组lncRNA HCG18、丙二醛水平依次显著升高（P＜0.001），GSH-Px、SOD水平依次显著降低（P＜0.001）。见表4。

表4 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）92例不同肝纤维化程度组血清lncRNA HCG18与氧化应激指标水平比较/

表4 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）92例不同肝纤维化程度组血清lncRNA HCG18与氧化应激指标水平比较/

注：lncRNA HCG18为长链非编码RNA人类白细胞抗原复合体18，GSH-Px为谷胱甘肽过氧化物酶，SOD为超氧化物歧化酶。①与排除晚期纤维化组比较，P＜0.05。②与中间状态组比较，P＜0.05。

SOD/（U/mL）81.45±12.52 66.52±10.25①49.13±8.29①②48.42＜0.001组别排除晚期纤维化组例数3 0中间状态组46晚期纤维化组F值P值16 lncRNA HCG18 1.20±0.25 1.39±0.30①1.65±0.35①②12.36＜0.001 GSH-Px/（U/mL）81.56±13.58 71.74±10.52①57.06±9.05①②24.27＜0.001丙二醛/（µmol/L）5.64±1.88 7.12±2.16①8.99±2.51①②13.06＜0.001

2.5 NAFLD组血清lncRNA HCG18水平与氧化应激指标、肝纤维化程度的相关性 Pearson相关性分析显示，NAFLD组血清lncRNA HCG18水平与丙二醛呈正相关（r=0.59，P＜0.001），与GSH-Px、SOD均呈负相关（r=-0.57、-0.62，P＜0.001）；Spearman相关性分析显示NAFLD组血清lncRNA HCG18水平与NFS评分呈正相关（r=0.69，P＜0.001）。

2.6 血清lncRNA HCG18对NAFLD诊断价值分析 ROC曲线结果显示，血清lncRNA HCG18诊断NAFLD的曲线下面积（AUC）95%CI为0.85（0.79，0.90），截断值为1.24，灵敏度为72.8%，特异度为86.7%，约登指数为0.60。

3 讨论

据估计，NAFLD患病人数约占全球人口的25%，已成为全球慢性肝病的常见病因［8-9］，中国NAFLD患病率高达25%，年增长率高达0.60%，是NAFLD患病率增长最快的国家［10］。由于NAFLD的发病并无典型症状，往往发现时已是晚期［2］，容易有肝硬化、肝衰竭、肝细胞肝癌等肝脏相关疾病，严重者因此死亡。因此，寻找能够早期诊断NAFLD的生物标志物，能够帮助临床采取有效干预措施，改善病人预后，具有重大的现实意义。

NAFLD发病较为复杂，目前已知其与胰岛素抵抗有关［11］。NAFLD病人由于肝脏受损，ALT、AST、GGT进入血液循环，病人体内三者含量明显升高，ALT、AST、GGT是诊断肝脏疾病的重要指标，能够反应肝脏病变严重程度［12］。本研究中，NAFLD组HOMA-IR、ALT、AST、GGT显著高于对照组，排除晚期纤维化组、中间状态组、晚期纤维化组病人HOMA-IR、ALT、AST、GGT依次显著升高。NAFLD病人体内的过量氧与清除过量氧的抗氧化系统的失衡是氧化应激产生的主要原因。病人体内过量氧自由基与不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，导致其代谢产物丙二醛增加［3］，由于过量氧自由基的存在，GSH-Px、SOD作为抗氧化酶发挥其抗氧化作用被大量消耗，机体抗氧化能力降低［13］。NAFLD的进展过程中往往伴随着肝纤维化，Angulo等［7］创建的NAFLD肝纤维化评分（NFS）系统能够证明肝纤维化程度，并可用于判定NAFLD病人的预后［14］。

lncRNA HCG18是一种具有肿瘤促进作用的lncRNA，在上皮性卵巢癌［15］、乳腺癌［16］中均呈现过表达。在肝细胞癌病人癌组织中，lncRNA HCG18表达升高，并可通过靶向miR-214-3p加速肿瘤进展［4］。本研究中，NAFLD组血清lncRNA HCG18表达水平显著高于对照组，这与Xia等［5］学者的研究结果具有一致性，表明lncRNA HCG18参与肝功能障碍的进展。lncRNA HCG18在NAFLD中可能是通过负向调控miR-197-3p，增加IL-18的表达参与NAFLD的病情进展［5］，IL-18产生的IFN-γ能够强烈诱导大鼠脂肪肝的发展［17］。排除晚期纤维化组、中间状态组、晚期纤维化组血清lncRNA HCG18依次升高。推测NAFLD病人肝纤维化程度越严重，lncRNA HCG18水平越高，IL-18水平越高，对肝细胞的损伤程度越严重。

NAFLD组血清丙二醛水平明显高于对照组，GSH-Px、SOD水平明显低于对照组，这与王永斌等［18］、谢文秀等［19］的研究结果一致。排除晚期纤维化组、中间状态组、晚期纤维化组丙二醛水平依次显著升高，GSH-Px、SOD水平依次显著降低。结果表明，纤维化程度越严重，lncRNA HCG18水平越高，机体氧-抗氧化系统失衡越严重，氧化应激反应越剧烈。Pearson相关性分析显示，NAFLD组血清lncRNA HCG18水平与丙二醛呈正相关，与GSH-Px、SOD均呈负相关；Spearman相关性分析显示NAFLD组血清lncRNA HCG18水平与NFS评分呈正相关，提示NAFLD病人血清lncRNA HCG18水平与氧化应激指标及肝纤维化程度关系密切。ROC曲线结果显示，血清lncRNA HCG18对NAFLD具有一定的诊断价值。

综上所述，NAFLD病人血清lncRNA HCG18表达水平升高，与氧化应激指标及肝纤维化程度存在一定的相关性，且对NAFLD具有一定的诊断价值，可作为NAFLD的生物标志物。但本研究所纳入样本数量较少，且并未对lncRNA HCG18的具体作用机制进行研究，同时由于所纳入的受试对象存在个体差异，试验数据可能存在一定的偏颇。同时仅对lncRNA HCG18一个指标进行了监测，未结合其他相关指标，也是本研究的不足之处，后续需扩大样本数量，结合其他相关指标，开展细胞实验或动物实验等基础研究进行更加深入的探讨。