葛根菊苣茯苓方对高尿酸血症大鼠的作用与机制研究❋

宋纪显,陈 琦,陈 捷,郭亚净,武双平,吉恩生,2

(1.河北中医药大学,石家庄 050200;2.河北省中医药结合氢医学技术创新中心,石家庄 050091;3.河北医科大学附属平安医院,石家庄 050000)

高尿酸血症(hyperuricemia, HUA)是一种代谢性疾病,通常由嘌呤代谢异常引起,以尿酸生成增多及排泄减少为主要特征,以血尿酸异常升高为主要表现[1],是痛风发生的直接因素,还会导致尿酸性肾结石、肾功能衰竭等严重并发症[2-3]。人民生活水平的提高和饮食结构的改变,使HUA的患病率呈现逐年升高的趋势[4]。由于HUA早期无明显症状,而西药治疗又因常见的不良反应导致长期用药受限。因此,寻找安全有效的中医药治疗方法对防治和延缓HUA并发症的发生具有重要意义。

HUA发作前症状多不明显,中医理论认为其属于“未病”或“伏邪”范畴[5]。本病病机总属虚实夹杂,多由“湿”邪引起,以脾肾不足为本,湿、热、痰瘀互结为标,病位在于筋骨,源于脾肾,故补肾健脾、利湿祛浊是其主要治则[6-8]。中医药治疗高尿酸血症的案例较多,多以清热利湿、除湿通络、益气健脾、泄浊祛瘀等为基本治则[9-10]。葛根菊苣茯苓方取《太平惠民和剂局方》所载参苓白术散健脾渗湿之义化裁而成,具有补肾健脾、清热利湿、化痰祛瘀之功效,方中山药健脾养胃、滋肾益精,葛根解肌退热、升阳止泻,共为君药;茯苓健脾利水,薏苡仁健脾渗湿,山楂行气散瘀、化浊降脂,陈皮健脾燥湿,共为臣药;菊苣、栀子、蒲公英清热利尿,百合养阴润肺,桑叶疏风清热,共为佐药;干姜温中散寒、缓和其他药物寒性,甘草补脾益气、调和诸药,共为使药,诸药配伍,共奏健脾补肾、清热利湿、化痰祛瘀之效[11-12]。现代药理学研究证实方中菊苣正丁醇提取物、葛根提取物葛根异黄酮具有促进尿酸排泄的作用[13-14],菊苣、葛根、桑叶配方使用可以降低高尿酸合并关节炎小鼠的尿酸水平[15],茯苓、山药均可不同程度降低HUA大鼠尿酸水平[16-17]。本实验建立HUA大鼠模型,同时以别嘌醇为阳性对照药,研究不同剂量葛根菊苣茯苓方对高尿酸血症大鼠尿酸水平的影响及其可能的作用机制,为葛根菊苣茯苓方的临床应用提供实验依据。本研究经河北中医药大学实验动物伦理委员会批准,编号:DWLL202304004。

1 材料

1.1 动物

清洁级雄性SD大鼠42只,8周龄,体质量(200±20)g,购自北京维通利华动物有限公司,动物许可证号:SCXK[京]2016-0 006。大鼠饲养于河北中医药大学实验动物中心,可自由进食、饮水,动物房室内保持相对稳定的温度和湿度。

1.2 主要药物与制备

葛根菊苣茯苓方由葛根、菊苣、茯苓、薏苡仁、山药、桑叶、栀子、蒲公英、百合、山楂、陈皮、干姜、甘草组成,以上药物由河北中医药大学国医堂提供,经河北中医药大学中药教研室鉴定均为正品。将上述中药饮片加入400 mL饮用水浸泡30 min,之后煎煮40 min,留取药液;第2次加水300 mL煎煮30 min,留取药液,将2次煎煮所得药液充分混合后过滤,按低、中、高剂量浓缩制备成含生药0.615 g、1.23 g、2.46 g的水煎液。氧嗪酸钾(货号:P831461,规格:100 g/瓶)、腺嘌呤(货号:A800685,规格:25 g/瓶),上海麦克林生化科技股份有限公司;别嘌醇(货号:S45825,规格:25 g/瓶),上海源叶生物科技有限公司。

1.3 主要试剂

苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色试剂盒(货号:G1120),北京索莱宝科技有限公司;血尿酸(serum uric acid,SUA)ELISA测定试剂盒(货号:GM1111)、血肌酐(serum creatinine,SCr)ELISA测定试剂盒(货号:GM1112)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)ELISA测定试剂盒(货号:GM1110)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)ELISA测定试剂盒(货号:GM1102)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)ELISA测定试剂盒(货号:GM1103)、GAPDH抗体(货号:GB15002),武汉赛维尔生物有限公司;腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)ELISA检测试剂盒(货号:A048-2-1)、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)ELISA检测试剂盒(货号:A002-1-1),南京建成生物工程研究所;有机阴离子转运体(organic anion,OAT)3抗体(货号:bs-0609R)、三磷酸腺苷结合转运蛋白(ATP-binding cassette sub-family G member,ABCG)2抗体(货号:bs-4780R),北京博奥森生物技术有限公司;尿酸盐阴离子转运体(recombinant urate transporter,URAT)1抗体(货号:GB111847)、有机阴离子转运体OAT1抗体(货号:GB113690)、葡萄糖转运蛋白(glucose transporter type,GLUT)9抗体(货号:26486-1-AP),武汉三鹰生物技术有限公司。

1.4 主要仪器

DM5000B型光学显微镜,德国Leica公司;Vilber Fusion FX5 Spectra型多功能成像系统,法国VilberLourmat公司;Varioskan LUX型多功能读数仪、 EPOCH 3020型全自动酶标仪,美国Thermo Scientific公司。

2 方法

2.1 分组与造模

将42只清洁级雄性SD大鼠随机分为7组(n=6):正常组、模型组、葛根菊苣茯苓方低剂量组(6.15 g/kg)、中剂量组(12.3 g/kg)、高剂量组(24.6 g/kg)、别嘌醇组(0.03 g/kg)、正常给药组(葛根菊苣茯苓方中剂量)。以上剂量根据《药理实验方法学》进行换算[18],相当于体质量为70 kg的成人每日用量的等效剂量。本实验造模过程及方法参考相关文献进行[19],除正常组及正常给药组外,其余各组大鼠每日灌胃氧嗪酸钾1.5 g/kg、腺嘌呤0.1 g/kg建立HUA模型,连续21 d。从第8天开始,除正常组与模型组外,其余各组大鼠每日灌胃葛根菊苣茯苓方及别嘌醇干预治疗,持续14 d,正常组与模型组给予等量蒸馏水。

2.2 样本采集

末次给药24 h后,腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉各组大鼠,股动脉取血,离心后取血清于-80 ℃冻存备用。大鼠仰卧位固定于手术操作板上,充分暴露腹腔,摘取肾脏、肝脏后用0.9%氯化钠溶液冲洗,肾脏拍照、称取质量。将部分肾脏组织取出并置于冻存管内,-80 ℃保存,用于Western blot检测;用4%多聚甲醛固定部分肾脏、肝脏组织,制备石蜡切片。

2.3 计算肾脏系数

统计各组大鼠体质量及肾脏质量,并计算肾脏系数(肾脏系数=肾脏质量/体质量)。

2.4 苏木精-伊红hematoxylin-eosin staining,HE染色观察肾脏、肝脏组织形态

取固定包埋的肾脏、肝脏组织制作石蜡切片(厚度3～4 μm),行HE染色,在显微镜下观察、采集图像。

2.5 ELISA检测

取冻存的大鼠血清,室温下溶解,参照ELISA试剂盒说明书,利用酶标仪检测各组大鼠血清中SUA、BUN、SCr、XOD、ADA、ALT、AST含量。

2.6 Western blot检测

肾脏组织剪碎后加入裂解液,离心后取上清液,二奎琳甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测定蛋白浓度。蛋白电泳,转膜,封闭,加入OAT1(1:1 000)、OAT3(1:1 000)、ABCG2(1:1 000)、URAT1(1:1 000)、GLUT9(1:1 000)、GAPDH(1:5 000)一抗4 ℃孵育12 h,再加入对应的二抗(1:10 000)常温孵育,增强型化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)显影,Image J定量分析,以目的条带/GAPDH灰度值作为目的蛋白的相对表达量,用GraphPad Prism 8.0绘制统计图。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 葛根菊苣茯苓方对HUA大鼠肾脏外观及肾脏系数的影响

正常组大鼠肾脏形态大小均正常,且色泽暗红,表面光滑,模型组大鼠肾脏变大,色泽变浅且表面皱缩而有颗粒感,见图1。模型组大鼠体质量与正常组比较明显下降(P<0.05),肾脏质量明显增加(P<0.05),肾脏系数显著增大(P<0.05);与模型组比较葛根菊苣茯苓方中剂量组与别嘌醇组大鼠肾脏质量明显降低(P<0.05),肾脏系数明显减小(P<0.05),见表1。

A.正常组;B.模型组;C.葛根菊苣茯苓方低剂量组;D.葛根菊苣茯苓方中剂量组;E.葛根菊苣茯苓方高剂量组;F.别嘌醇组;G.正常给药组

A.正常组;B.模型组;C.葛根菊苣茯苓方低剂量组;D.葛根菊苣茯苓方中剂量组;E.葛根菊苣茯苓方高剂量组;F.别嘌醇组;G.正常给药组

注:有机阴离子转运体1(OAT1),有机阴离子转运体3(OAT3),尿酸转运体1(URAT1),三磷酸腺苷结合转运蛋白2(ABCG2),葡萄糖转运蛋白9(GLUT9)A.正常组;B.模型组;C.葛根菊苣茯苓方低剂量组;D.葛根菊苣茯苓方中剂量组;E.葛根菊苣茯苓方高剂量组;F.别嘌醇组;G.正常给药组

A.正常组;B.模型组;C.葛根菊苣茯苓方低剂量组;D.葛根菊苣茯苓方中剂量组;E.葛根菊苣茯苓方高剂量组;F.别嘌醇组;G.正常给药组

表1 葛根菊苣茯苓方对HUA大鼠体质量、肾脏质量及肾脏系数的影响

3.2 葛根菊苣茯苓方对HUA大鼠血清中BUN、SUA、SCr、XOD、ADA水平的影响 ELISA结果显示模型组大鼠血清SUA、BUN、SCr、XOD、ADA含量与正常组比较明显升高(P<0.05),与模型组比较葛根菊苣茯苓方和别嘌醇组大鼠上述指标表达水平均有不同程度下降(P<0.05)。见表2。

表2 葛根菊苣茯苓方对HUA大鼠血清BUN、SUA、SCr、XOD、ADA的影响

3.3 葛根菊苣茯苓方对HUA大鼠肾脏组织形态的影响

HE染色结果显示正常组大鼠肾小球、肾小管形态结构基本正常,未见明显尿酸盐结晶与炎性细胞浸润;模型组大鼠肾小球部分萎缩,肾小管代偿性扩张,管内可见大小不等的空泡、炎性细胞浸润以及尿酸盐结晶。与模型组比较葛根菊苣茯苓方和别嘌醇组大鼠肾小球、肾小管病理改变均有不同程度改善。见图2。

3.4 葛根菊苣茯苓方对HUA大鼠肾脏OAT1、OAT3、ABCG2、URAT1、GLUT9蛋白表达的影响

Western blot结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肾脏组织OAT1、OAT3、ABCG2蛋白表达显著下降(P<0.05),URAT1、GLUT9蛋白表达显著上升(P<0.05);与模型组比较,葛根菊苣茯苓方和别嘌醇组大鼠肾脏组织OAT1、OAT3、ABCG2蛋白表达水平有不同程度上升,URAT1、GLUT9蛋白表达水平出现不同程度下降(P<0.05)。见图3、表3。

表3 葛根菊苣茯苓方对HUA大鼠肾脏组织中OAT1、OAT3、ABCG2、URAT1、GLUT9蛋白表达的影响

3.5 葛根菊苣茯苓方对HUA大鼠肝脏组织形态及ALT、AST水平的影响

HE染色结果显示各组大鼠肝脏组织形态基本正常,肝细胞索排列整齐,肝小叶结构大致清晰。血清ELISA结果显示各组大鼠间ALT、AST水平差异无统计学意义。见图4、表4。

表4 葛根菊苣茯苓方对HUA大鼠肝脏ALT、AST水平的影响

4 讨论

HUA是由嘌呤代谢障碍引起,以尿酸生成、排泄失衡为特征的代谢性疾病[20]。随着HUA发病率的逐年上升[21],寻找安全有效的中医药治疗方法十分必要。为此,本实验联合使用氧嗪酸钾和腺嘌呤建立HUA模型以模拟高尿酸血症,同时给予不同剂量葛根菊苣茯苓方干预,探究中医药治疗的效果及潜在机制。氧嗪酸钾可降低尿酸酶活性,腺嘌呤作为尿酸前体物质可促进尿酸合成,二者合用可升高尿酸[22-23]。别嘌醇可减弱黄嘌呤氧化酶的活性,抑制尿酸生成,故选用别嘌醇为阳性对照药作为疗效参考[24],另外单独设立葛根菊苣茯苓方组以观察此方对肝肾功能的影响。实验结果证实,模型组大鼠SUA、BUN、SCr水平与正常组比较明显升高,同时肾脏系数增加,肾脏呈灰白色且有颗粒感,肾小管出现不同程度扩张,说明模型制备成功。

HUA可导致机体SUA、SCr、BUN水平升高,SCr是由磷酸肌酸代谢生成的化合物,BUN是机体蛋白质代谢的主要终末产物,二者含量增高说明肾脏滤过功能受损[25],大量过饱和尿酸会在血液中形成结晶并沉积于肾小球、肾小管及肾间质,导致肾脏损伤[26]。ADA可催化腺嘌呤核苷转化为次黄嘌呤,核酸代谢酶XOD可与体内黄嘌呤和次黄嘌呤发生氧化反应并生成尿酸[27]。本实验结果证实,模型组大鼠肾脏系数与正常组比较明显升高,XOD、ADA水平升高;同时模型组大鼠肾小球部分萎缩硬化,出现尿酸盐结晶以及肾小管代偿性扩张。给予葛根菊苣茯苓方及别嘌醇治疗后,大鼠肾脏系数显著下降,肾脏病理损伤得到改善,SUA、BUN、SCr、XOD、ADA水平也出现不同程度下降,这说明葛根菊苣茯苓方可降低大鼠高尿酸水平,改善肾脏病理损伤。同时肝脏HE染色及ALT、AST结果显示各给药组肝脏均无异常病理变化,肝功能基本正常,说明葛根菊苣茯苓方没有明显的不良反应。

尿酸在肾脏中的代谢主要由尿酸盐转运蛋白调控,包括OAT1、OAT3、ABCG2、URAT1、GLUT9等均发挥重要作用。OAT1和OAT3主要分布在肾脏近曲小管基底膜侧,可通过介导有机阴离子化合物的转运加速尿酸排泄[28]。ABCG2是腺苷三磷酸结合“半转运体”蛋白,可促进肠道尿酸排泄[29]。URAT1可促进尿酸与肾小管上皮细胞中的阴离子交换;GLUT9可通过转运葡萄糖促进尿酸重吸收,二者表达上调可造成机体尿酸水平升高[30-31]。本实验结果显示,与正常组比较,模型组大鼠OAT1、OAT3、ABCG2蛋白表达水平明显降低,URAT1、GLUT9蛋白表达水平显著上调。而与模型组比较,给予葛根菊苣茯苓方后,OAT1、OAT3、ABCG2蛋白水平上升,URAT1、GLUT9蛋白水平下降,这说明葛根菊苣茯苓方可通过调控尿酸盐转运蛋白发挥调节尿酸作用。

综上所述,葛根菊苣茯苓方可通过调节尿酸盐转运蛋白干预大鼠体内尿酸的生成和排泄,发挥降尿酸作用,同时对肝肾功能没有明显不良反应。这为中药复方治疗HUA提供了实验参考和依据。