复方石榴皮药膜对金黄地鼠皮脂腺斑形态学及雄激素受体表达的影响*

张娟娟，朱飞云，吴淑辉，谢小丽，杨逸璇，朱明芳

（1.湖南中医药大学附属第二中西医结合医院，湖南 浏阳 410300；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

痤疮是一种毛囊皮脂腺单位的慢性炎症性疾病，患病年龄段覆盖儿童到中年两极[1]，其中青少年发病率最高。痤疮好发于面、胸背等皮脂分泌旺盛部位，愈合后易遗留凹陷性或增生性瘢痕，具有损容性。痤疮病因机制复杂。患者进入青春期后肾上腺及性腺的发育导致雄激素分泌增加。刺激皮脂腺功能增强，皮脂分泌增加是公认的痤疮发生发展的重要病理生理基础[2]。因此，减少雄激素分泌，抑制皮脂腺功能的亢进，调控皮脂稳态是治疗痤疮的重要思路和手段。近年来，较之西药外用药物，中药外治以其简便效廉，不良反应小，患者接受程度高，临床应用前景广阔[3]，在轻中度痤疮治疗中的地位愈发凸显，是国内外研究的重点[4]。

复方石榴皮药膜由石榴皮、桑叶、荷叶、茉莉花、紫苏叶、绿茶组成，具有清热解毒、祛脂化浊、消肿祛瘀功效。前期临床观察发现，将上药制成中药粗粉后清洗痤疮患者面、胸背部皮肤，能明显改善皮肤油腻感，减少皮脂分泌，增强祛痘疗效。本研究旨在探究复方石榴皮药膜对金黄地鼠痤疮模型的治疗作用及对雄激素受体（AR）表达的影响，以期为临床使用提供依据。

1 材 料

1.1 实验动物 SPF级雄性金黄地鼠15只，7周龄，体质量110～130 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0011。实验单位使用许可证号：SYXXK（湘）2020-0015。饲养条件：所有实验动物同一饲舍内分笼圈养，12 h光照及12 h黑夜并保持20 ℃恒温的人工环境中喂养标准饲料，适应性饲养1周后开始实验。本研究经湖南普瑞玛药物研究中心有限公司动物伦理委员会审查批准，审批号：IACUC-2021（5）037。所有操作均严格遵循实验动物管理相关规定。

1.2 药物与试剂 复方石榴皮药膜由石榴皮、桑叶、荷叶、茉莉花、紫苏叶组成，以上中药饮片由安徽盛海堂中药饮片有限公司生产，批号分别为2021101081、2021100375、2021100545、2021110375、2021110541。中药经浏阳市中医医院中药师谢宗明鉴定为正品。研极细粉后过120目筛，制成生药粉剂，各组分通过筛选取得最佳配比，混匀瓶装，备用。绿茶（长沙县金井茶厂出品，食品生产许可证：SC11443012100294）。0.025%维A酸乳膏（商品名：迪维，规格：15 g/支，国药准字：H50021817，重庆华邦制药有限公司）。苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（珠海贝索生物技术有限公司，批号：718091）；AR抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：P10275）；通用二步法试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：SP-9000）。

1.3 主要仪器 正置荧光显微镜（日本Olympus光学工业株式会社，型号：奥林巴斯BX53）；全封闭式组织脱水机（达科为[深圳]医疗设备有限公司，型号：HP300）；轮转石蜡切片机（徕卡显微系统[上海]贸易有限公司，型号：RM2235）；生物组织摊烤片机（武汉汉谷医疗科技有限公司，型号：HK-4）；生物组织石蜡包埋机（孝感市亚光医用电子技术有限公司，型号：YB-8LF）；全自动免疫组化染色仪（德国徕卡仪器有限公司，型号：Bond-Max）；冰箱（青岛海尔股份有限公司，型号：BCD-226SKA）；游标卡尺（上海量具刃具厂，规格：0～200 mm）；强光手电（深圳市神火照明有限责任公司，型号：C8-XPE）。

2 方 法

2.1 分组与给药 15只受试动物随机分为空白组、阳性对照组（0.025%维A酸乳膏组）、药膜组，每组5只。空白组外涂蒸馏水，不予任何药物处理。阳性对照组外涂0.025%维A酸乳膏，1 mL/次，给药后予遮光措施处理以防止药物见光分解。药膜组，每次使用时取10 g生药粉末以绿茶茶汁调制成药膜，将泥膏状药膜涂抹于无菌敷料上，2 mL/次，通过医用无纺布贴固定到金黄地鼠皮脂腺斑处，30 min后洗去。各组给药方法均为外用，给药部位为双侧皮脂腺斑处，2次/d，连续用药28 d。

2.2 观察指标

2.2.1 皮脂腺斑面积大小 干预开始后第0、14、28天，剃毛器剃除皮脂腺斑及周围皮肤毛发后，使皮脂腺斑充分暴露，金黄地鼠取俯卧位，在强光照射下，用照相机以同一焦距记录皮脂腺斑大体照片，游标卡尺分别测量并记录左、右两侧皮脂腺斑的最大横径（transverse diameter，DT）mm、最大纵径（longitudinal diameter，DL）mm，以DT×DL值计算皮脂腺斑面积，取两侧皮脂腺斑面积大小之和进行观察比较。

2.2.2 皮脂腺斑组织病理学 末次给药24 h后，剪取金黄地鼠左侧皮脂腺斑组织，放入10%甲醛固定液固定，经脱水、石蜡包埋、切片、HE染色后，镜下观察皮脂腺斑组织学形态变化。参考文献修订皮脂腺斑厚度变化的计算标准[5-6]：皮脂腺体积无明显变化，厚度较厚，重叠腺叶数0叶（-）；皮脂腺体积略有减小，厚度稍变薄，重叠腺叶数1叶（+）；皮脂腺体积有所缩小，厚度变薄，重叠腺叶数2～3叶（++）；皮脂腺体积显著缩小，厚度显著变薄，重叠腺叶数≥4叶（+++）。

2.2.3 免疫组织化学测量AR值 免疫组化AR阳性表达判定标准：染色区域为皮脂腺细胞核或细胞质中显示棕黄色颗粒。每张切片选取3个具有代表性的高倍视野（×200），根据染色呈阳性皮脂腺细胞的分布情况划分为：未见阳性细胞或者阳性细胞比例＜10%为阴性（-）；阳性细胞所占比例10%～≤25%为弱阳性（+）；阳性细胞所占比例＞25%且≤50%为阳性（++）；阳性细胞所占比例＞50%为强阳性（+++）。参考文献制定计数转换标准[6]：（-）=0，（+）=1，（++）=2，（+++）=3。

2.3 统计学方法 采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。计量资料若符合正态分布，采用“均数±标准差”（±s）表示。重复测量计量资料采用重复测量方差分析。3个及以上独立组的比较采用单因素方差分析，若满足方差齐性，两两比较采用LSD法，若不满足方差齐性，则采用塔姆黑尼法。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组金黄地鼠皮脂腺斑面积比较 第28天，肉眼观察可见阳性对照组、药膜组金黄地鼠的皮脂腺斑大体上小于空白组。第0天，空白组、阳性对照组、药膜组皮脂腺斑面积比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。3组金黄地鼠皮脂腺斑面积总体比较，差异无统计学意义（P＞0.05），即组间效应不明显。所有金黄地鼠皮脂腺斑面积在不同时间点比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在时间效应。3组金黄地鼠接受不同干预方法和时间之间存在交互效应（P＜0.05），即随时间的延长，空白组和阳性对照组、药膜组皮脂腺斑面积大小变化趋势不同。随着时间变化，空白组皮脂腺斑面积逐渐增大，阳性对照组和药膜组皮脂腺斑面积先增大后缩小。阳性对照组第28天与第14天比较，皮脂腺斑面积减小，差异有统计学意义（P＜0.05）。药膜组第14天、第28天分别与给药前比较，皮脂腺斑面积减小，差异均有统计学意义（P＜0.05）。第28天，药膜组与阳性对照组皮脂腺斑面积比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。（见图1～2、表1）

表1 3 组金黄地鼠皮脂腺斑面积比较 （±s，mm2）

表1 3 组金黄地鼠皮脂腺斑面积比较 （±s，mm2）

组别 n 第0天 第14天 第28天 F P空白组 5 90.30±13.21 103.02±9.90 123.47±17.04 7.464 0.008阳性对照组 5 88.66±20.88 112.91±4.80 98.05±6.23 4.502 0.035药膜组 5 93.29±11.00 122.40±10.58 112.11±10.87 9.359 0.004 F 0.113 6.089 5.442 P 0.894 0.015 0.021

图1 给药28 d 各组金黄地鼠皮脂腺斑大体图

图2 皮脂腺斑面积交互效应轮廓图

3.2 各组金黄地鼠皮脂腺斑组织形态及厚度比较 第28天，空白组皮脂腺腺体体积大，数量多，呈多层分叶状，排列厚且紧密整齐；阳性对照组皮脂腺腺体体积与空白组对比明显变小，厚度较空白组明显变薄，腺叶数减少，排列松散；药膜组皮脂腺腺体体积明显减小，部分腺体萎缩，分叶状结构较空白组减少，厚度较空白组明显变薄，排列明显疏松，个别视野有液化小囊形成。与空白组比较，阳性对照组及药膜组皮脂腺斑厚度明显变薄，差异均有统计学意义（P＜0.05）；阳性对照组与药膜组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图3、表2）

表2 第28 天各组金黄地鼠皮脂腺斑厚度、AR 比较（±s）

表2 第28 天各组金黄地鼠皮脂腺斑厚度、AR 比较（±s）

组别 n 皮脂腺斑厚度/mm AR空白组 5 2.60±0.55 2.40±0.55阳性对照组 5 1.60±0.55 1.20±0.45药膜组 5 1.00±0.71 0.60±0.55 F 8.909 15.750 P 0.004 0.000

图3 第28 天各组金黄地鼠皮脂腺斑病理变化比较（HE 染色）

3.3 各组金黄地鼠皮脂腺斑表达AR比较 第28天，免疫组织化学染色结果显示，AR阳性区域为皮脂腺细胞核。与空白组比较，阳性对照组及药膜组AR表达减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）；阳性对照组与药膜组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图4、表2）

图4 第28 天各组AR 免疫组化染色结果

4 讨 论

痤疮是累及毛囊皮脂腺单位的慢性炎症性皮肤病，好发于面、胸背等皮脂分泌旺盛部位。皮脂腺产生的脂类混合物称为皮脂，痤疮发病的重要因素是皮脂生成增多、含量增加，皮脂成分改变[7-8]。皮脂的分泌与雄激素调控的皮脂腺功能密切相关。调节雄激素水平，抑制皮脂腺功能亢进，维护皮脂稳态在痤疮防治中具有重要作用。目前外用较广泛的维A酸类药物、抗生素类药膏，因其容易导致皮肤干燥、灼热等不良反应及产生耐药性，一定程度上限制了其使用。因此，迫切需要开发天然安全无毒的中药抑脂祛痘产品解决痤疮患者油脂分泌过多的烦恼，为临床治疗痤疮提供新的手段。

中医外治专著《理瀹骈文》提出：“外治之理，即内治之理，外治之药亦即内治之药。所异者，法耳。”该观点为中医外治法提供了理论依据。朱明芳教授跟师湖湘中医皮病取象论治学派创始人欧阳恒教授十余年，学派取象论治法则之一的“以皮治皮”法是欧阳恒教授的主要临证学术思想。朱明芳教授尽得其传，临床运用以皮类中药石榴皮为主的组方外治于面部痤疮，在调控皮脂稳态方面收效颇佳[9-11]。复方石榴皮药膜组方以石榴皮为主药，均为常见的药食同源花叶类植物，药性温和无毒，使用安全。方中石榴皮，性味酸涩，具有收敛止血杀虫之效。课题组前期研究发现石榴皮有效成分石榴皮多酚具有抑制痤疮丙酸杆菌活性、抗瘢痕、抗金黄地鼠皮脂腺斑增生、调控皮脂稳态失衡的作用[12-14]。荷叶味苦、涩，性平，清暑利湿，升发清阳，凉血止血；桑叶性偏凉，味甘、苦、寒，有疏风清热解毒、凉血止血等功效。桑叶、荷叶可加强脂质代谢，增强脾胃运化，以清热解毒化浊增强疗效[15]。茉莉花味辛、甘，性温，具有解毒消肿、活血散瘀等效。紫苏叶辛、温，主解表、行气、和血。两药气味芳香，合用可明显改善机体糖代谢[16]。现代研究显示桑叶、荷叶、茉莉花、紫苏叶均具有降脂、抑菌、抗病毒、抗炎、抗敏等作用[17-20]。绿茶汁液治疗痤疮效果显著，对面部痤疮细菌具有抑制作用且作用随着汁液浓度的增加而增强[21]。

痤疮在中医学属“肺风粉刺”“面疱”等范畴。《外科正宗》言：“粉刺属肺……总皆血热郁滞不散。”《素问·至真要大论篇》谓“诸痛痒疮，皆属于心”。肺主皮毛，心主血脉。疏解客于皮毛的外邪、清解郁于心血的火热之邪是从脏腑辨证的角度分析论治痤疮的依据。本研究组方中的皮类药石榴皮以皮治皮，以皮走皮，引药直达病所。花、叶类药茉莉花、桑叶、荷叶、紫苏叶质轻味辛，轻扬浮散、能宣能透，具有轻疏灵动之性。轻者，轻解升清；疏者，疏动气机，和调气血。且辛散药物具有加强外用药物渗透的作用[22]。全方皮、花、叶合用，用于治疗好发于面部肌肤的痤疮疗效明显，可达宣畅、解毒、化湿、泄浊、散瘀之功。

金黄地鼠侧腹部皮脂腺斑是目前公认的可作为研究皮脂腺增生活性的较理想的动物模型[23]。皮脂腺斑的真实体积大小变化与药物的作用强弱呈较好的相关性[24]。本实验结果显示，阳性对照组、药膜组用药后金黄地鼠皮脂腺斑面积缩小，药膜组与阳性对照组金黄地鼠皮脂腺斑面积大小相当。组织病理学观察显示，复方石榴皮药膜干预能使金黄地鼠皮脂腺体积减小、厚度变薄、腺体层数减少、腺体萎缩等组织结构改变，提示复方石榴皮药膜对皮脂腺功能有抑制作用。

AR由配体结合结构域、核酸结合结构域和N端调控结构域组成，属于类固醇/核受体超家族[25]。AR可刺激皮脂腺皮脂过分泌，在调节皮脂分泌中起重要作用。AR能促进痤疮炎症反应的发生和发展[26]，但具体机制尚不明确，可能与其调节成纤维细胞生长因子受体2（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2）的活性，使皮脂腺的分泌处于平衡有关[27]，也可能与其增加皮脂固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs）的表达，刺激皮脂腺的皮脂分泌等因素有关[28]。因此，局部抑制雄激素受体可能是一种治疗痤疮有效的方法。本实验结果显示，复方石榴皮药膜外敷于金黄地鼠皮脂腺斑后雄激素受体表达量降低，故局部雄激素受体一定程度上受到抑制，进而对皮脂腺细胞产生抑制作用减少了皮脂分泌从而达到治疗效果。

综上所述，复方石榴皮药膜对金黄地鼠痤疮模型治疗效果确切，能有效减轻病理损伤，抑制皮脂腺增生。其作用机理可能与其抑制雄激素受体表达相关。