苦荞酒酒糟中酚类化合物成分分析及其体外抗氧化活性

赵佳伟 郑 佳,3 李 茂 张伟建 晏俊玲

苦荞属蓼料双子叶植物,富含氨基酸、蛋白质和多酚等营养元素[1-2],其中酚类化合物是其重要的保健成分。研究显示,苦荞中酚类化合物主要以芦丁、槲皮素为主,也含有原儿茶酸、绿原酸、山奈酚等物质[3],这些成分具有调节肠道菌群结构、抗炎、抑菌、抗氧化、降血糖等功效[4-5]。

作为一种药食同源植物,苦荞具有较高的营养食用价值和药用价值,可入药或作为食品,以苦荞为原料酿造的苦荞酒是许多少数民族的传统饮品[6],苦荞酒糟是其主要的酿造副产物。研究[7]表明,在蒸馏生产过程中,发酵物料中一些不挥发性组分如蛋白质、多糖和多酚等天然活性物质,基本残留在酒糟中。目前对苦荞酒酒糟的研究主要集中在饲料的开发、特定物质的提取等方面[8-9],而有关酒糟中天然活性物质的组成研究较少。试验拟利用HPLC和LC-MS相结合,对苦荞酒酒糟提取物中酚类化合物的组成进行分析,并对苦荞酒酒糟的抗氧化活性进行研究,以期为苦荞酒酒糟的综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦荞酒酒糟:实验室发酵型苦荞酒过滤后所得;

芦丁、槲皮素、山奈酚、山奈酚-3-o-芸香糖苷、没食子酸、原儿茶素标准品:北京伟业计量技术研究院;

异槲皮素:成都麦德生科技有限公司;

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、ABTS溶液:上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

氢氧化钠、亚硝酸钠等:分析纯,成都市科隆化学品有限公司;

乙腈、甲醇、乙醇:LC-MS级,美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪:1290系列,美国Agilent公司;

质谱检测器:6520B系列,美国Agilent公司;

紫外分光光度计:EVOLutIon 300型,美国Thermo Scientific公司;

高效液相色谱仪:1260型,美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 苦荞酒酒糟活性成分提取 将蒸馏过后的苦荞酒酒糟于55 ℃烘干,研磨,过60目筛。根据文献[10]对苦荞酒酒糟中酚类化合物进行萃取,过滤,收集滤液备用。

1.3.2 总黄酮含量测定

(1) 芦丁标准曲线制作:根据文献[10],以芦丁浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线方程y=0.073 5x-0.000 3,R2=0.999 92。

(2) 酒糟中总黄酮含量测定:取0.5 mL样品提取液,测定508 nm处吸光值,根据标准曲线计算出总黄酮浓度。以乙醇作为空白,按式(1)计算总黄酮含量。

X=(m×d)/W,

(1)

式中:

X——目标物总含量,mg/g;

m——由标准曲线计算出的目标物质量,mg;

W——样品质量,g;

d——稀释倍数。

1.3.3 总酚含量测定

(1) 没食子酸标准曲线制作:称取0.02 g没食子酸,用5 mL蒸馏水溶解,定容,得到2 mg/mL标准母液。采用福林酚法[11]测样品中总酚含量,以没食子酸浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线方程y=0.016 82x+0.002 7,R2=0.993 1。

(2) 酒糟中总酚含量测定:取1 mL样品提取液,测定765 nm处吸光值,根据标准曲线计算出总酚浓度。以20%的Na2CO3溶液作为空白,按式(1)计算总酚含量。

1.3.4 酒糟中酚类化合物的HPLC分析

(1) 黄酮类化合物:根据文献[12]并修改。流动相为乙腈(C相)和0.5%冰乙酸水溶液(B相);进样量10 μL;柱温35 ℃;流速1 mL/min;梯度洗脱程序:0～15 min,0～25% C;15～18 min,25%～27% C;18～35 min,27%～29% C;35～40 min,29%～30% C;40～55 min,30%～50% C。

(2) 酚酸类化合物:根据文献[13]并修改。流动相为甲醇(C相)和0.1 %甲酸水溶液(B相);10 μL进样量;柱温30 ℃;流速1 mL/min;梯度洗脱程序:0～8 min,5%～8% C;8～17 min,8%～10% C;17～20 min,10%～12% C;20～25 min,12%～15% C;25～33 min,15%～22% C;33～50 min,22%～50% C。

1.3.5 苦荞酒糟中酚类化合物的LC-MS分析

(1) 样品前处理:取10 mL酒糟提取液于45 ℃旋蒸除乙醇,用水稀释至10 mL,将液体用HLB小柱过滤,0.1 g/L甲酸水淋洗,90%甲醇水溶液洗脱,氮气吹干待测。

(2) 色谱条件:根据文献[14]。

(3) 质谱条件:采用电喷雾电离源(DESI),负离子模式扫描,离子源温度325 ℃,干燥气流量10 L/min,雾化器压力0.3 MPa,碰撞电压110 V。

1.3.6 苦荞酒酒糟提取物的体外抗氧化活性

(1) DPPH自由基清除能力:根据文献[15],按式(2)计算DPPH自由基清除率。

R=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%,

(2)

式中:

R——自由基清除率,%;

Ai——517 nm处的吸光值;

Aj——乙醇代替样品在517 nm处的吸光值;

A0——蒸馏水代替酒糟提取液在517nm处的吸光值。

(2) 羟自由基清除能力:根据文献[16],按式(2)计算羟自由基清除率。

(3) ABTS+自由基清除能力:根据文献[15],按式(2)计算ABTS+自由基清除率。

(4) FRAP法测定酒糟提取物抗氧化能力:根据文献[17]并修改。取20 μL不同质量浓度酒糟提取液(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL),加入FRAP工作液180 μL混匀,加入0.5,1.0,2.0,4.0,5.0 mmol/L硫酸亚铁溶液。建立标准曲线y=0.028 1x+1.460 5,R2=0.995 7。抗氧化活性以亚铁当量表示(FRAP,mmol/L)。

1.4 数据分析

采用Origin 2018软件制图,采用SPSS 18.0软件进行Duncan多重比较和方差分析,显著性水平为0.05,字母不同表示具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 酚类物质含量

试验测得苦荞酒酒糟中总黄酮含量为(20.714±0.320) mg/g,总酚含量为(5.708±0.250) mg/g。经发酵后的苦荞酒酒糟中总黄酮和总酚含量均高于苦荞原料(总黄酮12.970 mg/g,总酚4.910 mg/g),可能是由于在发酵前对苦荞原料进行了浸泡处理,而浸泡会激活苦荞中的多种酶类,在酶作用下将结合态的黄酮类和酚类物质水解成游离态[18]。此外,发酵过程中的微生物可以将植物细胞壁中的纤维素、果胶等大分子物质分解,改变细胞壁通透性,使其更好溶出[19]。

2.2 酚类化合物HPLC分析

2.2.1 黄酮类化合物 由图1可知,酒糟中黄酮类化合物包括芦丁、异槲皮素、山奈酚-3-o-芸香糖苷、槲皮素和山奈酚。相关研究表明,苦荞中黄酮类化合物含量丰富,其中以芦丁、槲皮素为主[20];四川苦荞中也含有山奈酚、山奈酚-3-o-芸香糖苷等物质[21-22],与试验结果相似。此外,苦荞酒糟中含有异槲皮素,说明发酵后的苦荞酒糟中也含有丰富的黄酮类化合物。

1. 芦丁 2. 异槲皮素 3. 山奈酚-3-o-芸香糖苷 4. 槲皮素 5. 山奈酚

2.2.2 酚酸类化合物 由图2可知,苦荞酒糟中含有的酚酸类化合物主要为没食子酸和原儿茶素。杨红叶等[23]研究显示,苦荞中含有没食子酸、原儿茶素、香草酸、咖啡酸、阿魏酸。试验酚酸类化合物只检出了没食子酸和原儿茶素,除了因原材料不同外,也可能是由于原料中的酚酸类化合物随发酵进入了发酵液,而留在酒糟中的含量及种类相应减少导致的。

1. 没食子酸 2. 原儿茶素

2.3 酚类化合物的LC-MS分析

由图3可知,苦荞酒糟提取物中含有7种酚类化合物,LC-MS检测结果与HPLC的相似,说明苦荞酒酒糟中富含酚类物质。由表1可知,黄酮类化合物中芦丁含量最高为(9.350±0.050) mg/g、其次为槲皮素、异槲皮素、山奈酚-3-o-芸香糖苷和山奈酚;酚酸类化合物中,没食子酸含量为(0.254±0.030) mg/g、原儿茶素含量为(0.352±0.040) mg/g。综上,发酵后的苦荞酒酒糟中含有7种酚类物质,其中芦丁含量最高。陈月等[24]研究表明,芦丁为苦荞粉中重要的酚类物质,含量一般可达8.99 mg/g。与孙坤坤[3]的研究结果相比,苦荞酒酒糟中山奈酚-3-o-芸香糖苷和山奈酚的含量高于其结果,槲皮素含量则相似;此外,与杨红叶等[23]相比,苦荞酒酒糟中酚酸类化合物(原儿茶素和没食子酸)含量均高于其试验结果,说明经过发酵蒸馏后,苦荞中的酚类物质基本残留在酒糟中,并未进入到酒体中,因此可以对酒糟进一步加工开发。

表1 苦荞酒酒糟中目标物质出峰时间、质荷比、线性方程

图3 苦荞酒糟中酚类化合物总离子流图

2.4 酒糟提取物的体外抗氧化活性

2.4.1 羟自由基清除能力 由图4(a)可知,当样品质量浓度为0.1～0.5 mg/mL时,羟自由基清除率随样品质量浓度的增加而上升。维生素C的清除能力要稍强于苦荞酒酒糟。当酒糟提取物质量浓度达到0.5 mg/mL时,羟自由基清除率为(73.29±0.09)%。与茶酒酒糟相比(其半抑制浓度为2.74 mg/mL),苦荞酒酒糟有着更强的羟自由基清除能力[25]。半抑制浓度(IC50)越小,抗氧化能力越强,且苦荞酒酒糟和维生素C的IC50相差不大,分别为0.032,0.018 mg/mL,说明苦荞酒酒糟有着较好的羟自由基清除效果。

图4 苦荞酒酒糟提取物抗氧化活性

2.4.2 ABTS+自由基清除能力 由图4(b)可知,随着样品质量浓度不断增加,苦荞酒酒糟对ABTS+的清除率呈先增加后趋于平缓的趋势。当质量浓度为0.4 mg/mL时,清除率可以达到(96.00±0.98)%。在低浓度下(<0.3 mg/mL)苦荞酒酒糟的清除能力低于维生素C,但在质量浓度>0.4 mg/mL时,清除能力与维生素C的基本一致。酒糟和维生素C的IC50分别为0.052,0.02 mg/mL,与白酒酒糟(IC50为0.44 mg/mL)的结果相似[26]。说明苦荞酒酒糟在一定质量浓度条件下对ABTS+自由基有着较强的清除效果。

2.4.3 DPPH自由基清除能力 由图4(c)可知,DPPH自由基清除率与浓度呈正相关,随着样品质量浓度的增加,DPPH自由基清除率也不断提高。与维生素C相比,低浓度的苦荞酒酒糟对DPPH自由基的清除力较弱,但随着质量浓度不断增加,差距不断缩小,在0.5 mg/mL时清除力达到(82.55±0.68)%。苦荞酒酒糟和维生素C的IC50值分别为0.24,0.03 mg/mL,说明苦荞酒酒糟对DPPH自由基有着一定的清除能力。

2.4.4 FRAP还原铁能力 由图4(d)可知,随着样品质量浓度的上升,苦荞酒酒糟的FRAP值显著升高。当质量浓度<0.4 mg/mL时,苦荞酒酒糟的还原力低于维生素C的;当质量浓度为0.5 mg/mL时,FRAP值为(2.49±0.09) mmol/L,与维生素C的还原力基本一致,说明样品质量浓度较高时,苦荞酒酒糟具有较强的抗氧化能力。

3 结论

试验表明,苦荞酒酒糟中总黄酮含量为(20.714±0.320) mg/g,总酚酸含量为(5.708±0.250) mg/g。利用HPLC和LC-MS相结合,对苦荞酒糟中酚类化合物的组成进行了分析,共检测出7种物质(5种黄酮类化合物和2种酚酸类化合物),其中芦丁含量最高达到(9.350±0.050) mg/g,其次为槲皮素、异槲皮素、山奈酚-3-o-芸香糖苷和山奈酚,经发酵蒸馏后,苦荞中的酚类物质基本残留在酒糟中。抗氧化评价结果显示,随着样品质量浓度的增加,其抗氧化能力逐渐提高,当样品质量浓度为0.5 mg/mL时,对羟自由基、ABTS+自由基、DPPH自由基的清除率分别为(73.29±0.09)%,(96.21±0.25)%,(82.55±0.68)%,FRAP值为(2.49±0.09) mmol/L。在低质量浓度下,苦荞酒酒糟对羟自由基和ABTS+自由基表现出较好的清除效果,说明苦荞酒酒糟具有较好的体外抗氧化活性。但是,研究还未对苦荞酒酒糟提取物中全部的酚类化合物进行鉴定,后续将进一步对其进行分离鉴定。