茶叶中草甘膦及其代谢物氨甲基磷酸的绿色检测分析

李贝贝 汪 薇 江 丰 王会霞 陈 锂

草甘膦(glyphosate,Gly)是一种广谱、灭生性、氨基酸类除草剂,对多年生杂草非常有效,是目前使用量最大的除草剂之一[1-2],被广泛用于茶园、果园等。若不按照规范使用会造成草甘膦残留,长期食用含草甘膦的茶叶会增加患非霍奇金淋巴瘤癌症的风险[3]。研究[4]表明,植物会代谢草甘膦产生氨甲基膦酸(amino methyl phosphoric acid, AMPA),作为草甘膦的代谢标志物,AMPA对水生生物和哺乳动物具有长期的毒性作用,且具有蓄积性。GB 2763—2021规定草甘膦在茶叶中的最大残留限量为1 mg/kg,茶叶中的草甘膦不符合食品安全国家标准的情况时有发生[5],影响了中国茶叶产业的发展。

草甘膦为极性离子型农药,溶于水而不溶于有机溶剂[6],与茶叶中的有机物具有很强的结合能力,对其残留量分析的难度较大[7]。常用的检测方法有免疫法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、气相色谱—氮磷检测法、气相/液相色谱—质谱联用法[7-9]和高效液相色谱—高分辨质谱法[10-11]等。采用气相/液相色谱—质谱联用法检测均需衍生化,操作复杂、时间长[1,12],且由于结构中存在氨基和磷酸基团,草甘膦与AMPA在流动相中容易形成内盐,导致在普通反相色谱柱中的保留能力差。亲水作用色谱柱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)虽然可以改进保留能力,但需要平衡的时间长,重复性也较差,且均需要使用大量的有机溶剂,易造成环境污染。绿色分析检测技术是以无污染或少污染理念为核心内容,弥补了传统食品检验技术有机溶剂消耗大等的不足,可最大限度减少或消除分析过程中有害物的产生,将环境污染降到最低[13]。同时,草甘膦与AMPA在水溶液中易形成离子化合物,因此可以利用离子交换柱分离草甘膦残留,经抑制器转换成电导值高的离子型化合物[14-15],不需要衍生,对于这类亲水性农药残留的测定有特殊的优势[16]。离子色谱的流动相多为NaOH、KOH水溶液,有机试剂使用量小,且抑制反应产物为水[17-18],符合绿色分析化学要求[17-19]。

目前,离子色谱法主要应用于食品中离子型化合物的检测,如测定现煮咖啡中氯酸盐[20]以及水果和蔬菜中高极性阴离子农药的多残留等[16,21],且多以水质等基质干扰相对较小的样品分析为主[22-24],主要是由于基质复杂,干扰因素较多,以致在离子色谱检测器端杂峰较多,检出限难以得到保证[25],而茶叶的基质效应更是仪器分析的难点[26-27]。茶叶中大量的色素、氨基酸等物质必然会严重干扰离子色谱测定草甘膦和AMPA的信号,限制离子色谱在茶叶分析中的应用。将离子色谱与串联质谱联用(ion chromatography tandem mass spectrometry, IC-MS/MS)可提高对于茶叶等复杂基质分析的抗干扰能力和灵敏度,但还需要针对茶叶样品基质特征和草甘膦等的理化性质,优化与IC-MS/MS分析配套的前处理方法,探究IC-MS/MS在茶叶中草甘膦及AMPA检测的适用性。QuEChERS是一种基质固相分散的快速样品处理技术,通过吸附剂与样品中的杂质相互作用,如各种糖类、有机酸、色素等,从而使基质复杂的样品能实现快速、高效和经济的分离提取,可针对茶叶基质干扰严重的特点进行改进优化。

研究拟利用QuEChERS前处理技术,结合IC-MS/MS法同时检测茶叶中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸,通过优化仪器参数、改进前处理方法,建立无需衍生化的茶叶中草甘膦和AMPA检测方法,以期提高检测效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草甘膦、氨甲基磷酸标准品:纯度99.0%,上海安谱实验科技股份有限公司;

内标13C2,15N-草甘膦:纯度97.1%,上海安谱实验科技股份有限公司;

氢氧化钠:优级纯,国药集团化学试剂有限公司;

试验用水为超纯水;

乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)、石墨化炭黑(GCB):美国Supelco公司;

茶叶:市售。

1.2 仪器与设备

三重四极杆质谱仪:TSQ Altis型,美国赛默飞世尔科技公司;

高压离子色谱仪:Thermo ICS-5000型,配EGC淋洗液发生器、辅助泵、AS-AP 自动进样器、ASRS300 2 mm阴离子抑制器、电导检测器,美国赛默飞世尔科技公司;

离子色谱柱:IonPac AS11-HC型,4 μm×2 mm×250 mm,美国赛默飞世尔科技公司;

离心机:Centrifuge 5810型,艾本德中国有限公司;

涡旋仪:IKA MS3 digital型,德国IKA公司;

电子天平:ME 204型,梅特勒—托利多仪器上海有限公司;

去离子水发生器:Milli-Q型,美国Millipore公司。

1.3 试验方法

1.3.1 前处理方法

(1) 标准溶液配制:分别取草甘膦、氨甲基膦酸和内标13C2,15N-草甘膦标准品,用超纯水溶解并配制成质量浓度为1 μg/mL的标准储备液。用超纯水梯度稀释成质量浓度为5,10,20,50,100,150,200 ng/mL的标准溶液工作曲线。

(2) 样品处理:将茶叶样品粉碎过网筛,称取5 g 样品,加入同位素内标工作液,用20 mmol/L NaOH水溶液定容,涡旋1 min,超声提取20 min,4 000 r/min 离心5 min。取2 mL 上清液加入净化剂(150 mg PSA、15 mg C18、15 mg GCB),涡旋1 min,过0.22 μm水相滤膜,IC-MS/MS检测。

1.3.2 离子色谱条件 采用AS11-HC-4 μm(2 mm×250 mm)离子色谱柱;淋洗液浓度为35 mmol/L NaOH 溶液,等度淋洗,流速为0.35 mL/min;AERS 2 mm抑制电导检测器,抑制电流为70 mA,抑制器再生水流速1 mL/min。柱温25 ℃,进样量600 μL;初始30 s后,通过六通阀将流量注入离子源[16]。

1.3.3 质谱条件 离子源为加热ESI源,质谱扫描方式为负离子多反应监测模式(MRM),喷雾电压2 500 V,离子传输管温度350 ℃,雾化器温度450 ℃,其他质谱参数见表1。

表1 MRM参数†

1.4 方法学考察

用峰面积对浓度进行线性回归,得到线性回归方程和相关系数[28]。将阴性茶叶基质提取液逐级稀释获得草甘膦和氨甲基膦酸的检出限(LOD,S/N≥3)和定量限(LOQ,S/N≥10)。取茶叶样品阴性基质,分别添加1,2,10倍LOQ的草甘膦和氨甲基膦酸标准品溶液,每个加标水平平行6次,计算平均加标回收率和相对标准偏差(RSD)。

1.5 数据采集和分析

所有试验重复3次,分别通过Xcalibur、Tracefinder进行质谱数据的采集和草甘膦及氨甲基膦酸的定性定量分析。应用SAS 9.0、GraphPad Prism 5和Design-Expert 11软件进行数据统计和绘图。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的选择

草甘膦和氨甲基膦酸在负离子模式下的质谱信号响应值高于正离子模式,因此选择负离子模式进行分析。分别对两种化合物及其稳定同位素内标的质谱条件包括锥孔电压、碰撞能量等进行优化,优化后的质谱参数见表1。草甘膦和氨甲基膦酸的质谱特征碎片离子见图1。

图1 草甘膦和氨甲基膦酸的质谱特征碎片离子

2.2 离子色谱条件优化

比较两种阴离子分析柱IonPac AS16-9 μm(4 mm×250 mm)和AS11-HC-4 μm(2 mm×250 mm)对草甘膦和氨甲基膦酸的分离效果。结果表明,草甘膦在两种阴离子柱中均呈良好的峰型,氨甲基膦酸在IonPac AS16中峰展宽,有明显的拖尾,在AS11-HC中具有较好的保留,峰型良好。从草甘膦和氨甲基膦酸的结构来看,草甘膦中额外存在的羧酸基团使其在离子色谱柱上的保留能力比氨甲基膦酸的大。因此,选择阴离子柱AS11-HC-4 μm(2 mm×250 mm)。

图2 草甘膦和氨甲基膦酸的总离子流图和提取离子色谱图

2.3 提取条件的选择

草甘膦水溶性极强,不溶于有机溶剂。目前用于草甘膦提取的溶剂主要有水、碱溶液、酸溶液等[1],SN/T 1923—2007等现行标准中多采用超纯水作为提取溶剂。但由于离子色谱对样品提取液的离子强度较为敏感,进而影响后续检测结果的准确度,因此需要探索适合IC-MS/MS茶叶中草甘膦和AMPA的提取方法。分别选择超纯水、NaOH水溶液(10,20,30 mmol/L)作为提取溶剂,同时比较振荡提取和超声波辅助提取两种方式,考察不同提取溶剂和提取方式对草甘膦和AMPA提取效率的影响,结果见图3。采用碱性溶液作为提取溶剂,有利于将被茶叶有机质结合的草甘膦和AMPA变成离子形态,提高回收率。随着NaOH浓度的提高,草甘膦和AMPA的回收率随之提高,当采用20 mmol/L的NaOH溶液提取时,二者的回收率达最大值,继续增大NaOH浓度,草甘膦的回收率趋于平稳,AMPA的回收率有所降低。与振荡提取相比,超声辅助提取下茶叶中草甘膦和AMPA的回收率升高,可能与草甘膦为内吸性农药有关[1]。因此,采用20 mmol/L的NaOH水溶液超声辅助提取的方法。

图3 提取条件对茶叶基质中草甘膦和氨甲基磷酸回收率的影响

2.4 净化方式的选择

茶叶中丰富的色素、多糖、茶多酚等内源性物质对草甘膦和氨甲基磷酸IC-MS/MS检测结果影响较大,茶叶基质的有效净化是排除假阳性结果的关键[9]。目前对于草甘膦、氨甲基膦酸净化多使用固相萃取柱,SN/T 1923—2007等前处理均采用阳离子交换柱(CAX)净化,使用CAX小柱时不能采用真空泵抽气,必须采用常压过柱方式,不得使小柱干涸,需要多次调节样品提取液的pH值,且固相萃取柱价格较高[9]。试验采用吸附剂(PSA、C18和GCB)对茶叶提取液进行净化,在前期单因素分析基础上[7],根据Box-Behnken中心组合设计原理,以目标物回收率为响应值设计响应面试验,对净化剂用量进行优化,考察不同净化剂对茶叶基质净化效果的影响,结果如图4所示。

图4 吸附剂净化对茶叶基质中草甘膦和氨甲基磷酸回收率的影响

由图4可知,PSA和GCB用量的等高线为椭圆形,交互作用显著,C18用量与二者的交互作用均不明显。PSA可有效去除样品中的糖、有机酸、脂肪酸等极性化合物,而草甘膦和氨甲基膦酸也属于强极性化合物,过多的PSA会对二者产生吸附;C18可吸附脂肪等非极性物质;GCB可吸附色素、甾醇等[7]。综合样品的净化效果及目标化合物的回收率,最终确定加入150 mg PSA、15 mg GCB和15 mg C18对茶叶基质进行净化。

2.5 基质效应评价

采用茶叶基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率比值评价基质效应(ME)[32],ME>0为基质增强效应,ME<0为基质抑制效应,0≤|ME|≤20%为基质对待测物的信号干扰程度较低,|ME|≥50%为基质效应干扰强烈[26,32]。如图5所示,未净化时茶叶基质中草甘膦和氨甲基膦酸表现为强基质抑制效应,尤其是氨甲基膦酸,可能是由于茶叶中氨基酸、色素或类似结构的干扰所致[8]。净化后基质效应显著降低,说明净化是必要且有效的,茶叶中草甘膦的ME<15%,基质干扰较低,氨甲基膦酸的ME为24%～29%,存在中等程度的基质效应,可采用矩阵匹配曲线来减少茶叶样品中复杂成分对定量过程的不利影响。

图5 草甘膦及氨甲基膦酸在4种茶叶中的基质效应

2.6 方法学评价

2.6.1 线性范围、检出限与定量限 由表2可知,草甘膦和AMPA在5～200 ng/mL质量浓度范围内有良好的线性关系,其相关系数均>0.998。草甘膦和AMPA的检出限均为0.05 mg/kg,定量限为0.10 mg/kg。茶叶中草甘膦的最大残留限量为1 mg/kg,试验方法灵敏度可以满足GB 2763—2021的要求。

表2 草甘膦和氨甲基膦酸的线性范围、相关系数、检出限和定量限

2.6.2 特异性 如图6所示,茶叶基质成分未对草甘膦及氨甲基膦酸检测造成干扰,无杂峰干扰,方法的特异性良好。

图6 方法的特异性

2.6.3 回收率与精密度 为考察试验方法在不同茶叶类型中的适用性,按制茶工艺选取空白绿茶、红茶、白茶和普洱茶样本,进行3个水平的加标回收试验,方法的回收率及精密度见表3。由表3可知,草甘膦和氨甲基膦酸的平均加标回收率分别为61.2%～104.9%,61.5%～83.2%,RSDs均<20%,符合GB/T 27404—2008 的要求。

表3 不同茶叶基质中草甘膦和氨甲基膦酸的回收率和精密度

2.7 实际样品分析

采用试验方法对市售绿茶(23份)、红茶(3份)、白茶(2份)、普洱茶(2份)共30批次茶叶样本进行测定,其中1批次绿茶样品中检出草甘膦残留,其含量为0.074 mg/kg。试验方法操作简便易行,无需衍生化,可以用于实际样品的检测。

3 结论

研究建立一种离子色谱串联质谱(IC-MS/MS)测定茶叶中草甘膦及其代谢物氨甲基磷酸的方法。该方法前处理简单,样品经简单水提取和稀释后基于IC-MS/MS进行分析,无需衍生化或预浓缩。针对茶叶基质干扰问题,利用分散萃取净化代替固相萃取小柱,优化净化剂配比,同时结合同位素内标及基质标曲对数据进行校准后,将茶叶基质效应降低至可接受范围,各项方法学指标令人满意。试验方法有机溶剂使用量小,无需衍生,符合绿色化学的理念,结果稳定准确,可操作性强,且方法学评价结果满足茶叶中草甘膦及其代谢物的日常检测要求,具有实际应用价值。后续可利用毛细管离子色谱技术对试验方法进行持续改进。