N6-甲基腺苷修饰在呼吸系统疾病中的研究进展

韩永康,杜毓锋,钱 力,李 丹,孙梓越,刘学军

(1.山西医科大学,山西 太原 030012;2.山西医科大学第一医院老年病科,山西 太原 030001)

随着空气污染、吸烟及老龄化等因素的影响,慢性呼吸系统疾病已成为我国居民的主要死因,同时对家庭、社会产生沉重的经济负担,各级医疗机构需要对其重点防治[1]。近年来,越来越多的证据表明表观遗传因素在呼吸系统疾病发展中发挥重要作用,RNA甲基化是重要的表观遗传修饰方式之一,其中N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰在真核生物中广泛存在。m6A修饰水平失调可导致多种肺部疾病的发生,与其调节因子(甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白)的异常减少或增加密切相关。m6A 修饰为肺部疾病发生、发展提供新的分子机制,给疾病的治疗提供新策略、新方法。

1 m6A修饰

m6A修饰是 RNA腺嘌呤碱基上的第6位氮原子发生甲基化,在真核生物表观遗传修饰中广泛存在,还可调控非编码RNA代谢[2]。m6A 的生物学过程主要依靠调控因子的参与,通过动态调控基因转录后表达水平维持细胞生物学功能。m6A修饰数量和分布特征可通过抗体免疫共沉淀技术、高通量测序及m6A敏感性RNA核糖核酸酶的测序技术等获得[3]。

m6A甲基转移酶常以复合物形式发挥生物学作用,甲基转移酶样蛋白3(Methyltransferase-like protein,METTL3)通过与S-腺苷甲硫氨酸结合获得甲基转移酶活性,作为甲基转移酶活性的核心成分介导细胞核中的RNA甲基化。而甲基转移酶样蛋白14(Methyltransferase-like protein 3,METTL14)间接参与催化甲基转移,可与METTL3以1∶1的比例形成稳定的异二聚体,维持复合物完整性以及与底物RNA结合,单独的METTL3具有较弱的催化活性,只有与METTL14结合后才会增强METTL3的催化作用[4]。也有研究发现METTL3-METTL14复合物对体外DNA损伤区域有一定的修复作用[5]。Wilms肿瘤抑制1相关蛋白(Wilms tumor 1-associating protein,WTAP)与METTL3-METTL14复合物相互作用,促进复合物定位于核散斑,激活甲基转移酶的催化活性以及与靶标RNA结合。同时还有多种调控因子与催化复合物结合,目前已知的Vir样m6A相关甲基转移酶、RNA结合基序蛋白(RNA binding motif proteinl5 14,RBM15)及其同源蛋白RBM15B、METTL16、具有CCCH结构锌指蛋白13等,它们主要负责RNA特定位点的甲基化[6]。去甲基化酶可对已发生 m6A 修饰的碱基进行去甲基化修饰,揭示了m6A修饰是动态可逆的。目前发现两种去甲基化酶,肥胖相关蛋白(Fat mess and obesity us sociated,FTO)和烷基化蛋白 AlkB 同源物5(AlkB homolog 5,ALKBH5),二者均属于二价铁/α-酮戊二酸盐依赖的AlkB双加氧酶家族。研究发现ALKBH5在癌症中起着致癌或抗癌的双重作用[7],需要进一步深入研究表观遗传学调控规律。甲基化阅读蛋白可识别发生 m6A-RNA 甲基化的碱基并激活下游的调控通路,调节甲基化RNA剪接、核输出、降解、翻译等过程[8]。

2 m6A修饰与呼吸系统疾病

近年来有研究表明,m6A修饰与呼吸系统疾病的发生发展密切相关,如肺纤维化、哮喘、肺癌、慢性阻塞性肺疾病等。RNA m6A 修饰与呼吸系统疾病的发生发展密切相关,可能给呼吸系统疾病的发生提供新的分子机制,给疾病的治疗提供新策略、新方法[9]。

2.1 m6A修饰与肺纤维化 肺纤维化是一种不可逆转的慢性致命性肺部疾病,表现为炎症损伤后组织修复异常,肌成纤维细胞过度增殖和活化,可引起肺部结构损伤、功能障碍,最终导致器官衰竭。肺纤维化发病机制复杂,目前药物治疗对肺纤维化只能起缓解作用,不能从根本上逆转或治愈该疾病,因此,早期诊断和寻找肺纤维化的潜在药物治疗靶点尤为重要[10]。国外研究表明m6A 甲基化修饰可能为肺纤维化的诊断和治疗带来新的希望,根据HUANG等[11]的研究,发现富含亮氨酸的PPR基序蛋白和FTO可评估疾病预后和提供治疗靶点,m6A调控因子可预测肺纤维化的患病率。成纤维细胞转换的肌成纤维细胞 (Fibroblast to myofibroblast transition,FMT)是肺纤维化中主要的胶原蛋白生成细胞[12],是引起肺纤维化的最重要的病因。因此,避免肌成纤维细胞的过度增殖和活化,维持其稳态是防控肺纤维化的重点。相关研究发现m6A 修饰可直接参与肺纤维化相关通路,从而实现调控FMT过程。如ZHANG等[13]发现,在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型和肺纤维化患者肺部样本中,可通过沉默METTL3来降低RNA m6A修饰水平,从而抑制FMT增殖和活化。另外,根据DENG等[14]研究成果表明,在博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型和人肺纤维化样本中METTL3存在异常表达,METTL3可被视为诊断肺纤维化发生的重要生物标志物以及药物治疗的靶标。总之m6A 修饰与肺纤维化的形成密切相关,针对m6A调控因子药物的研发可能为肺纤维化的治疗提供新的策略。

另外,随着空气污染及吸烟等因素的影响,肺纤维化的发生率逐年升高,急性粉尘颗粒可导致体细胞基因组RNA甲基化改变[15]。有研究表明长期吸入各种含量过高的游离粉尘颗粒(炭黑、PM2.5或二氧化硅)沉积于肺组织可影响m6A 修饰水平,导致肺部出现不可逆性纤维化,其中以成纤维细胞过度增殖和细胞外基质在肺组织内沉积过多为特征[16],致肺功能出现不可逆性的下降,最终使患者的呼吸功能丧失。如经碳黑处理后的大鼠肺组织中Pri-miRNA-126的m6A修饰水平下调,引起下游靶向调控基因PI3K介导的PI3K/AKT/mTOR通路激活,导致肺组织发生纤维化[17]。PM2.5暴露通过降低ALKBH5水平,使靶向Yes相关蛋白1(Yes-associated Protein 1,YAP1)-mRNA 的 miRNAs水平下降,激活调节肺部炎症的YAP1信号通路,促进细胞外基质沉积最终导致肺纤维化[18]。

二氧化硅诱导的肺纤维化同样受m6A修饰的影响,如WANG等[19]研究说明,METTL3可促进肺成纤维细胞的活化、迁移,并通过circRNA m6A修饰参与二氧化硅诱导的肺纤维化。ZHANG等[20]发现,ALKBH5、FTO表达水平下调而METTL3表达上调,在二氧化硅诱导肺纤维化形成中发挥了重要作用。然而,根据SUN等[21]研究,在二氧化硅诱导的肺纤维化小鼠组织中ALKBH5表达增加,其对转化生长因子TGF-β1刺激成纤维细胞活化过程中起促进作用,抑制ALKBH5表达可在体外发挥抗纤维化作用,其机制是ALKBH5通过miR-320a-3P/FOXM1轴或直接靶向调控FOXM1促进二氧化硅诱导的肺纤维化。ALKBH5低表达抗纤维化或致纤维化的矛盾结果,一方面表明表观遗传学在肺纤维化中的重要作用,另一方面也显示了转录后基因表达调控的复杂性。考虑其矛盾结果与RNA m6A修饰检测尚无公认的参考方法,样本数量较少、评价结果的标准不一,不同实验室研究结果缺乏可比性等因素相关,此后还需要开展大规模的随机对照试验,找到其关键的调控分子及其作用靶点。

2.2 m6A修饰与慢性阻塞性肺疾病 慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种常见的以持续存在的呼吸系统症状和气流受限为特征的肺部疾病,病程较长且起病缓慢,主要症状为咳嗽、咳痰、活动后气短,严重影响患者生活质量。我国COPD患者数量庞大,吸烟是COPD发生的重要因素[22]。有研究发现香烟烟雾可诱导 METTL3 过表达,并在支气管上皮细胞中产生大量成熟的 microRNA-93(miR-93),miR-93激活氨基末端激酶(JNK)通路,上调诱导弹性蛋白降解的基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶12的水平,从而导致肺气肿[23]。相关调节蛋白异常表达,与肺部血管损伤和肺功能下降密切相关,可诱发COPD急性加重[24]。细颗粒物(PM2.5)暴露也是COPD发生发展的重要原因,PM2.5使m6A调节因子METTL16表达上调,调节硫酸酯酶2的表达,诱导血管内皮细胞凋亡、增加血管通透性、减少血管生成,导致肺微血管损伤,从而促进COPD的发生发展,同时也为COPD的治疗提供了新的靶点[25]。肺泡巨噬细胞极化在COPD发展过程中发挥重要作用[26],有研究报道,COPD患者体内FTO表达较低,而过表达FTO可调节 PM2.5刺激后肺泡巨噬细胞的极化和相关信号通路活性,因此FTO可能在COPD发展中发挥重要作用[27]。HUANG等[28]研究发现,m6A修饰与COPD的发生高度相关,其调控因子METTL3、FTO等可协同发挥作用,影响COPD进展关键基因的表达而促进COPD的进展,但具体的作用机制仍需进一步研究。综上所述,m6A调控因子与COPD发生发展密切相关,该因子为COPD的治疗提供了新的靶点,应对其机制进行深入研究,以期实现基础研究与临床之间的转化。

2.3 m6A修饰与哮喘 哮喘是严重危害人类健康的慢性呼吸道疾病。因其反复发作,严重影响患者生活质量。目前有研究表明RNA甲基化修饰与哮喘发生发展密切相关[29]。DAI等[30]研究成果表明,m6A调节因子在儿童哮喘的发生中起着不可忽视的作用,利用m6A调节因子可预测儿童哮喘发作的风险,针对m6A修饰的研究可能为儿童哮喘的治疗提供有效的策略。FAN等[31]研究发现,哮喘患者外周血CD3 T细胞中有较高的METTL4表达,提高了m6A修饰水平。有研究发现[32],人气道上皮中FTO缺失可导致FOXJ1 mRNA不稳定,使纤毛细胞数量明显减少,敲除FTO的小鼠在过敏原刺激时可有强烈的哮喘样表型。在严重哮喘中m6A调控因子同样发挥关键作用,对重度哮喘有重要意义的嗜酸性粒细胞受到m6A调节因子的影响,该机制可能为未来的哮喘治疗提供新见解[33]。哮喘是一种慢性炎症性疾病,涉及复杂的基因作用。SUN等[34]研究,验证了哮喘患者中三个m6A修饰的关键基因(BCL11A,MATK和CD300A),发现它们主要分布在外显子中,富集在3’ UTR中,对m6A修饰的基因进行干预可能为哮喘的治疗提供新思路。LIN等[35]发现,m6A、m1A、APA和A-to-I修饰是最有效的RNA修饰,在严重哮喘的发生中起重要作用。另外MO等[36]。发现DNA甲基化和m6A修饰之间同样存在相互作用,并且发现白藜芦醇可能靶向调控失调的m6A基因,可以作为哮喘的潜在治疗剂。总之,m6A 修饰在哮喘发生发展过程中发挥了重要作用,不同修饰方式之间的相互作用也有重要的研究意义,为哮喘患者治疗带来新策略、新方法。

2.4 m6A修饰与肺癌 全球肺癌新发病例达到210万,死亡病例达到180万,肺癌的发病率、病死率在所有肿瘤中排在首位,提高肺癌的诊疗水平显得尤为重要[37]。在肺癌发生发展过程中,上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是癌细胞获得侵袭力的关键。SUPHAKHONG等[38]研究表明,METTL3高表达可调控EMT进程,从而促进肺癌的发生和转移。也有研究发现ALKBH5表达下调、METTL3表达上调可促进肺癌发生发展,通过提升ALKBH5和敲除METTL3表达来降低m6A水平,从而抑制癌细胞中3D球体的生成和小鼠肺内肿瘤的形成[39]。然而,另有研究报道ALKBH5高表达可促进非小细胞肺癌进展,敲低其表达可抑制体内肿瘤生长,ALKBH5可降低TIMP3 mRNA的稳定性从而抑制其表达,ALKBH5/TIMP3通路可促进肺癌细胞增殖同时抑制其凋亡[40]。探索过程中有些研究结论相互冲突,ALKBH5高表达可抗癌或致癌及抗纤维化或致纤维化的不同结论,矛盾的结果说明表观遗传学在肺癌及肺纤维化过程中发挥着重要作用。肺纤维化患者患肺癌的风险很高,抗纤维化治疗可减缓疾病进展,并可能延长生存期,但RNA m6A 修饰具体的调控机制需要进一步研究[41]。

目前判断肺癌预后多集中于临床特征,如肿瘤的TNM分期、分化程度以及胸膜是否受累等。由于大部分肺癌患者就诊时已处于晚期,所以寻求早期诊断肺癌的生物学标志物、尽早进行治疗显得尤为重要。m6A修饰为开发高精度、低成本、侵入性小的新型生物标志物及大规模癌症筛查提供了新的方向和策略。ZHANG等[42]通过研究血清样本发现,m6A-miRNAs标记在包括肺癌的多种癌症类型中表现出优异的灵敏度,且其诊断性能不受性别、年龄等因素的干扰。近年来,相关研究发现m6A调节因子与肺癌患者预后显著相关。LIU等[41]研究发现,METTL3与非小细胞肺癌患者预后显著相关,可作为患者的预后指标。综上所述,以m6A甲基化为代表的表观遗传学修饰,在肺癌的发生发展、诊断、治疗及预后中发挥着重要作用。

3 总结与展望

慢性呼吸系统疾病(纤维化、COPD、哮喘、肺癌等),给我国带来了沉重的医疗负担。针对m6A 修饰在慢性呼吸系统疾病的深入研究,加深了对表观遗传学调控规律的认识,同时对疾病发病机制、诊断、新药作用靶点及判断预后提供了重要的理论依据。尽管肺部疾病相关研究已有进展,但关于m6A修饰还有许多关键问题需要解决。一方面,m6A修饰检测尚无公认的参考方法,其调控因子并未被完全鉴定出来,并且目前研究结果仍存在争议,具体功能和调控机制仍需要继续深入探索,以期增强表观遗传学调控规律的理解。m6A修饰在肺部疾病的病理过程中机制复杂,找到其关键的调控分子及其调控靶点是重点也是难点。另外,调节因子及基因为靶点的药物研发成果相对缺乏,此后还需要开展大规模、高质量的基础和临床研究,制定出合理且科学的评价体系,实现基础研究到临床应用之间的转化,为患者的诊治带来新策略、新方法。